褪黑素對糖尿病大鼠非酶糖基化產(chǎn)物及受體表達和心臟功能變化的影響

崔剛 張東東 韓雪 孫權(quán)

(1佳木斯大學基礎醫(yī)學院，黑龍江 佳木斯 154007；2保山中醫(yī)藥高等專科學校)

糖尿病心肌病(DCM)由Hamby等〔1〕于1974年首次提出，是一種糖尿病患者特殊的心肌病變，由糖尿病繼發(fā)而來，且獨立于冠心病和高血壓之外，以心肌能量代謝或結(jié)構(gòu)異常改變導致心肌細胞重塑，通過影響心肌細胞重塑最終引起心臟收縮舒張功能障礙〔2〕。DCM臨床發(fā)病率高，危害大，現(xiàn)公認為常見和嚴重的糖尿病慢性并發(fā)癥之一，成為現(xiàn)今研究的熱點〔3，4〕。研究表明，沉積于心血管組織，由蛋白質(zhì)和殘留糖發(fā)生非酶化反應生成的糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)在糖尿病心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展中極其重要〔5〕。AGEs 可與其受體(RAGE)結(jié)合并激活一系列信號轉(zhuǎn)導通路進而誘導成纖維細胞增殖〔6〕。作為免疫球蛋白超蛋白的一種細胞表面分子，RAGE與其他受體存在明顯不同。一般受體會受到增加的配體水平的反饋性抑制，而RAGE 則會因為配體水平的升高增加其表達〔7〕。褪黑素(MT)屬于吲哚類激素，由松果體分泌，對人類的睡眠、生殖及晝夜節(jié)律等起到調(diào)節(jié)作用，對機體的神經(jīng)、內(nèi)分泌和免疫系統(tǒng)均有影響。研究證實MT對糖尿病并發(fā)癥具有良好的干預作用，并已試用于糖尿病腎病的治療〔8〕。本研究探討MT對DCM大鼠心臟的保護作用及其機制。

1 材料與方法

1.1模型建立和分組 80只Wistar大鼠清潔級雄性(長春億斯實驗動物技術(shù)有限責任公司)，體重200～220 g，分籠飼養(yǎng)于佳木斯大學動物實驗中心，自由攝食和飲水，每天光照12 h。隨機分為正常組、模型組、MT低劑量組和MT高劑量組，每組20只，分籠飼養(yǎng)。除正常組外，其余3組都給予高脂高糖飲食4 w。大鼠禁食12 h，腹腔內(nèi)(按50 mg/kg體重)注射1%鏈脲佐菌素(STZ，美國Sigma公司)。給藥后72 h尾靜脈采血，空腹血糖≥16.7 mmol/L為造模成功。實驗時每4 w檢測血糖一次。造模后每天10∶00至14∶00 MT(浙江延年褪黑素公司)灌胃一次，MT低劑量組劑量為10 mg/kg體重，MT高劑量組劑量為20 mg/kg體重，正常組和模型組同等劑量生理鹽水灌胃。持續(xù)給藥16 w。

1.2血糖值測定和計算心臟指數(shù) 給藥前、后，測量前禁食、水12 h，尾靜脈采血，血糖儀測量血糖值。分別檢測大鼠空腹血糖。大鼠血流動力學指標檢測之后，每組部分大鼠沿心底大血管根部剪下心臟，生理鹽水沖洗，濾紙吸干，精確稱量心臟質(zhì)量，心臟指數(shù)=心臟質(zhì)量/體質(zhì)量，稱量后迅速將心臟放進-80℃冰箱凍存。

1.3心臟功能指標檢測 10%水合氯醛0.03 ml/kg體重腹腔注射麻醉大鼠，固定在大鼠用手術(shù)臺上，用彎剪剪去下頜骨至鎖骨范圍的毛。用1 ml注射器向右頸總動脈內(nèi)注射500 U/kg體重肝素，并在生理記錄儀的插管內(nèi)注滿肝素。依次切開皮膚、筋膜，暴露氣管，用玻璃分針游離右側(cè)頸總動脈，分離注意避免傷及神經(jīng)。結(jié)扎右側(cè)頸總動脈遠心端，近心端留手術(shù)線備用，用動脈夾夾閉右頸總動脈近心端，靠近遠心端剪一斜口(血管不剪斷)，插入生理記錄儀插管，動脈夾放開一下，血管充盈，將插管向心臟方向插入1 cm，用手術(shù)線扎好(松緊適宜)，放開動脈夾，將插管螺旋插入4～5 cm，觀察生理記錄儀讀數(shù)，舒張壓為0 mmHg即插入左心室。使用生理記錄儀，測量左室收縮壓(LVSP)、左室舒張期末壓(LVEDP)、室內(nèi)壓最大上升速率(+dp/dtmax)、室內(nèi)壓最大下降速率(-dp/dtmax)和室內(nèi)壓上升達最大速率所需時間(t-dp/dt)等心功能指標。

1.4收集標本 斷髓法處死實驗大鼠，剪開胸骨，打開胸腔，暴露心臟。沿著心底大血管的根部剪斷心臟，剖開右心耳，由左心室進針用200 ml左右生理鹽水沖洗，當右心耳流出無色液體時可以停止沖洗，再用4%多聚甲醛溶液進行心臟固定，游離心臟放入10%中性甲醛溶液內(nèi)浸泡后將組織制成5 μm厚石蠟切片。

1.5HE染色 ①脫蠟至水;②蘇木素染色6 min，蒸餾水沖洗5 min;③1%鹽酸-乙醇分化30 s，再次蒸餾水沖洗5 min;④伊紅染色3 min，蒸餾水沖洗5 min;⑤脫水透明;⑥中性樹膠封片;⑦顯微鏡下組織學觀察并拍照。

1.6免疫組化染色 ①烤片30 min;②脫蠟脫水后將切片放入盛有Tris鹽酸緩沖液(TBS)的抗原熱修復盒中，放入微波爐中加熱至煮沸，20 min后取出，自然冷卻，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次，各5 min;③5%牛血清白蛋白(BSA)封閉液，37℃，20 min;④一抗(RAGE濃度為1∶50，AGE濃度為1∶100)，4℃過夜;⑤復溫至室溫，PBS洗3次，各5 min;⑥試劑Ⅰ，37℃ 20 min，PBS洗3次，各5 min。試劑Ⅱ，37℃ 20 min，PBS洗3次，各5 min;⑦二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，鏡下觀察，隨時中斷，蒸餾水洗3次，各3 min;⑧蘇木素染色片刻，1%HCl-酒精分化30 s，蒸餾水洗3次，各5 min，自來水沖洗2 h(AGE染色時，省略此步);⑨脫水透明;⑩中性樹膠進行封片;圖像采集分析采用BI200軟件。所得的IOD數(shù)值越大，AGE與RAGE蛋白的表達越差；數(shù)值越小，AGE與RAGE蛋白的表達越好。

1.7統(tǒng)計學處理 使用SPSS19.0軟件進行方差分析。

2 結(jié) 果

2.1精神狀態(tài) 正常組狀態(tài)活潑，每日進食量和飲水量穩(wěn)定，體重隨周齡增加而平穩(wěn)增加，眼睛有神發(fā)亮，行為動作反應快速，常出現(xiàn)打鬧現(xiàn)象，皮毛光滑有光澤，鼠尾色澤紅潤，大、小便正常。模型組狀態(tài)萎靡，每日進食量和飲水量增多、過頻；體重增加隨周齡增加而遲緩，有的甚至出現(xiàn)停滯；反應速度有些遲鈍，出現(xiàn)抱團扎堆現(xiàn)象，皮毛暗淡不平順、無光澤，眼神目光呆滯，鼠尾顏色發(fā)白，小便過頻、大便時干時稀不規(guī)律。MT低劑量組和MT高劑量組精神狀態(tài)尚可，每日進食量和飲水量趨于正常，體重增加緩慢，隨周齡增長增加緩慢；日常活動略有增加，但動作略有遲緩；皮毛略有柔順、光澤，眼睛發(fā)灰，略顯呆滯，鼠尾毛色略有光澤，大便略稀，小便趨于正常。

2.2血糖、體重和心臟指數(shù) MT處理16 w后，與正常組比較，模型組、MT低劑量組和MT高劑量組血糖和心臟指數(shù)明顯升高(P<0.05)，模型組和MT低、高劑量組體重顯著降低(P<0.05);與模型組比較，MT低劑量組和MT高劑量組血糖值略降低，心臟指數(shù)略升高，但無統(tǒng)計學差異(P>0.05)(表1)。

表1 各組空腹血糖值、體重及心臟指數(shù)

2.3心臟功能 與正常組比較，模型組心功能LVSP降低、LVEDP升高、+dp/dtmax和-dp/dtmax降低、t-dp/dt升高，差異具有顯著性(P<0.05)；MT低、高劑量組心功能LVSP、LVEDP、+dp/dtmax、-dp/dtmax、t-dp/dt差異不顯著(P>0.05)；與模型組比較，MT低、高劑量組LVSP升高、LVEDP降低、+dp/dtmax和-dp/dtmax升高、t-dp/dt降低，差異具有顯著性(P<0.05)，MT低、高劑量組差異不顯著(P>0.05)。見表2。

表2 各組心功能指標比較

2.4心肌HE染色結(jié)果 正常組心肌細胞體積正常，排列整齊，心肌各層均勻，結(jié)構(gòu)清晰；胞質(zhì)清澈，胞質(zhì)顏色正常；心肌細胞核圓形或橢圓形，染色質(zhì)分布均勻。模型組心肌細胞體積明顯增大，排列紊亂、腫脹，心肌各層次不均，結(jié)構(gòu)不清；胞質(zhì)渾濁，胞質(zhì)顏色變淺；細胞核呈長桿狀，核固縮，核膜皺縮，出現(xiàn)雙核，排列紊亂，染色質(zhì)邊聚于核膜下呈顆粒狀。MT低劑量組和MT高劑量組心肌細胞體積略小，排列趨于整齊，心肌各層次結(jié)構(gòu)和心肌細胞間隙略清晰可以辨認；胞質(zhì)略有渾濁，顏色略淺，細胞核形態(tài)趨于正常的圓形或橢圓形，染色質(zhì)均勻可見。MT低劑量組較MT高劑量組更明顯(圖1)。

圖1 各組心肌HE染色(×400)

2.5心肌AGE和RAGE蛋白表達 AGE蛋白棕黃色陽性表達見于心肌細胞胞質(zhì)或心肌細胞間質(zhì)內(nèi)，RAGE蛋白棕黃色陽性表達多見于心肌細胞膜上。處理16 w后，與模型組比較，MT低劑量組和MT高劑量組AGE、RAGE蛋白表達IOD值明顯升高(P<0.05)；與正常組比較，MT低劑量組和MT高劑量組AGE和RAGE蛋白表達差異不顯著(P>0.05)(表3和圖2)。

表3 各組心肌組織中AGE和RAGE蛋白表達

圖2 各組心肌中AGE、RAGE蛋白免疫組化(×400)

3 討 論

生理狀態(tài)下，人和哺乳動物血清中MT的含量隨著晝夜交替，呈節(jié)律性的波動，其分泌量表現(xiàn)為，夜間比白天要高出5～10倍，正常情況下，凌晨2∶00～3∶00達到分泌量最高值。研究表明，MT對糖尿病大鼠血糖的影響有兩種觀點：①MT可以通過改善胰島素抵抗程度〔10〕和調(diào)控胰島β細胞胰島素的分泌釋放〔11，12〕，影響機體胰島素的代謝，并能促進細胞對葡萄糖的利用，從而影響機體的血糖代謝，直接降低糖尿病大鼠血清中的血糖水平；②也有報道〔13〕顯示MT對血糖水平?jīng)]有影響，研究者認為這可能由實驗過程中給藥時間、給藥方式和給藥劑量不同等所致。

隨著糖尿病進展，高血糖可導致心臟膠原沉積誘發(fā)心肌間質(zhì)纖維化，還可提高AGEs含量，提高心肌硬度〔14〕。研究表明，STZ誘導的糖尿病大鼠8～12 w心肌細胞超微結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，6～14 w發(fā)生心功能下降〔15〕。本實驗提示糖尿病大鼠心肌形態(tài)改變、收縮和舒張功能下降。而使用MT進行處理的糖尿病大鼠心肌形態(tài)得到明顯改善，心功能各項指標也得到了很好的控制。

在糖尿病的微血管并發(fā)癥中，RAGE信號通路扮演著重要角色〔16〕。AGE廣泛存在于機體的血液及各種組織、細胞中，AGE作用廣泛，通過兩種途徑發(fā)揮其生物學效應：①直接途徑，直接修飾改變蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸等的空間結(jié)構(gòu)和功能，造成機體損傷；②間接途徑，AGE與特異性受體RAGE結(jié)合后，導致機體發(fā)生病理性改變，可激活多個細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導通路，可誘導生成氧自由基及滅活一氧化氮(NO)等，參與不同類型細胞的氧化應激反應、炎性反應和血栓形成的過程〔17〕。高血糖狀態(tài)下，蛋白質(zhì)發(fā)生糖基化后，氧自由基生成也隨之增加，并促進AGE形成，從而導致惡性循環(huán)〔16〕。AGE生成具有不可逆性，即使糾正了高血糖，AGE也不能降至正常水平，且可在組織中繼續(xù)不斷地累積。因此，AGE在DM并發(fā)癥發(fā)生和發(fā)展全過程中起到重要作用。

RAGE廣泛存在于人體各類細胞中，屬于多配體受體，不僅參與內(nèi)體炎癥反應，還與糖尿病慢性并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。RAGE與AGE結(jié)合后，激活相關(guān)信號反應，使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜電位去極化和減少糖原合成酶激酶(GSK)-3β磷酸化，導致細胞功能障礙。糖尿病可以引起心房重構(gòu)，擾亂心房內(nèi)傳導系統(tǒng)，是房顫的危險因素之一。AGE與RAGE的結(jié)合與DCM發(fā)生密切相關(guān)，阻斷兩者的結(jié)合可能會成為預防和治療DCM的新靶點〔18，19〕。綜上，MT可抑制糖尿病大鼠AGE和RAGE蛋白間的相互影響，從而減輕DCM時的心肌損傷程度，延緩病程。

致謝：黑龍江省北藥與功能食品優(yōu)勢特色學科建設項目的支持。