2株固氮菌的分離與鑒定

陸依琳 趙晴雨 彭學

摘要：氮是植物生長過程中不可或缺的元素，目前人們主要采用化學方法生產氮肥，但是這種方法存在很多缺陷。固氮菌（nitrogen-fixing bacteria）作為一種有機營養型細菌，由于其具有嚴格好氧的特點，每年都可以固定得到1億t以上的氮肥，在解決氮素來源問題上顯示出了巨大的潛力。旨在以葡萄糖為唯一碳源，以江蘇師范大學的校園土壤為研究對象，在Ashby培養基上進行固氮菌的分離。結果表明，從江蘇師范大學校園土壤中共分離得到2株固氮菌，分別命名為菌株610、611;根據革蘭氏染色和生理生化分析結果，菌株610、611均為革蘭氏陰性菌，菌株610生長的最適溫度為 35 ℃，最適pH值為7，菌株611生長的最適溫度為30 ℃，最適pH值為8。2株菌株的16S rDNA測序結果顯示，菌株610與Arthrobacter nitrophenolicus（硝基酚類節桿菌）的相似度為99.49%，菌株611與Pseudomonas fulva（黃褐假單胞菌）的相似度為98.95%。試驗結果為今后高效生產固氮菌生物肥料提供了參考。

關鍵詞：固氮菌;分離;鑒定;硝基酚類節桿菌;黃褐假單胞菌

中圖分類號：S182

文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2020）16-0298-04

植物在生長過程中對氮素的需求量極大，因為氮是組成氨基酸的基本元素，而氨基酸則是構成蛋白質的基本單位。氮氣（N2）體積約占空氣總體積的80%，且氮在空氣中主要以游離狀態存在，而生物體只能吸收利用化合態氮，因此需要依靠某些微生物體內的固氮酶來固定空氣中游離的氮[1]。1972年，巴西的Dobereine在研究禾本科植物根際時發現了具有固氮作用的固氮菌，它能利用體內的固氮酶把空氣中植物無法吸收的氮氣轉化成氨態氮，并將其固定為植物可以直接利用的氮肥，該發現立即吸引了眾多科研工作者的目光，他們因此對固氮菌展開了各方面的研究并獲得了令人滿意的成果[2]。

固氮菌主要有自生固氮菌、共生固氮菌和聯合固氮菌3種類型。目前，人們對固氮菌的研究主要集中在固氮菌形態學、細胞學和生理生化特征等幾個方面，有些科學家則致力于研究適合固氮菌生長的營養條件、生長方式等。固氮菌除了具有基本的固氮功能外，還能產生維生素、生長素，進而促進農作物的生長發育，改善農作物質量[3]。Kumar等通過設計許多試驗研究固氮菌對谷物的作用，結果表明，固氮菌在多數情況下都能提高谷物的產量[4]。固氮菌肥與化學肥料相比，具有安全環保的生態效益，施用固氮菌肥可以節約大量原料，并在一定程度上避免對環境造成污染[5]。不斷加強土壤固氮菌的篩選、改良、馴化等應用研究，對于減少化學肥料的使用量、促進農業的綠色可持續發展、優化土壤質量等具有重大意義。目前，通過基因工程技術將固氮基因轉移至植物體內從而使植物能夠發揮固氮作用已經成為一項世界性的熱點課題。許多國家的科學家都熱衷于運用現代生物技術進行固氮菌的固氮機制和轉移微生物固氮能力等方面的研究，并取得了不錯的成果，展現出用固氮菌進行生物固氮的良好前景[6]。

本試驗以從江蘇師范大學校園環境中分離純化得到的固氮菌為研究對象，探究其生理生化特性，以期為后續生產高質量的固氮菌肥提供基本的理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗所用材料為江蘇師范大學校園內土壤。

1.2 試劑

KH2PO4（上海生工，純度≥99.0%），MgSO4·7H2O（上海生工，純度≥99.0%），NaCl（上海生工，純度≥99.5%），CaSO4·2H2O（北京寰宇科創生物科技發展有限公司，純度≥99.0%），CaCO3（上海生工，純度≥99.0%），葡萄糖（上海生工，純度≥99.5%），瓊脂（上海生工），LB肉湯（上海生工），草酸銨結晶紫（上海生工），番紅（上海生工），無水乙醇（上海生工，純度≥99.7%），碘液（上海生工），95%乙醇（用無水乙醇配制），細菌基因組抽提試劑盒（寶日醫生物技術有限公司），瓊脂糖（寶日醫生物技術有限公司），50×TAE（自配），1×TAE（自配），DNA marker（寶日醫生物技術有限公司），DNA loading buffer（寶日醫生物技術有限公司），Gold View（寶日醫生物技術有限公司），16S rDNA擴增試劑盒（寶日醫生物技術有限公司）等。

1.3 菌株分離

以葡萄糖為唯一碳源，在Ashby培養基[7]上分離菌株。首先在液體培養基中進行富集培養，然后經平板涂布、三區劃線之后，獲得固氮菌的單菌落。將菌液與80%甘油水溶液按1 ∶ 1體積比混合后保存于 -80 ℃ 冰箱中。

1.4 菌種的鑒定

1.4.1 革蘭氏染色 對菌株進行革蘭氏染色[8]，并在顯微鏡下觀察鑒定。若菌落呈紫色，則為革蘭氏陽性菌;若呈紅色，則為革蘭氏陰性菌。

1.4.2 16S rDNA測定 用試劑盒提取固氮菌的全基因組DNA，并以此為模板進行16S rDNA擴增[9]。

PCR反應體系見表1，混勻后放入PCR儀中進行擴增，PCR程序如下：95 ℃預變性5 min;95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，30次循環;72 ℃保溫10 min。PCR結束后，取2 μL反應液與 2 μL DNA loading buffer混勻，并以3 μL DNA marker作為對照進行瓊脂糖凝膠電泳，檢測PCR擴增是否成功。擴增成功后將PCR反應液純化，然后送到至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.5 最適溫度的篩選

在3 mL LB液體試管中過夜培養固氮菌，轉移100 μL菌液于100 mL LB液體培養基中，設3個錐形瓶為1組平行，將各組同時放入轉速為180 r/min的搖床中，并設置不同的溫度梯度，5 h后測定D600 nm[10]。

1.6 最適pH值的篩選

在3 mL LB液體試管中過夜培養固氮菌，轉移100 μL菌液于100 mL具有不同pH值梯度的LB液體培養基中，以3個錐形瓶為1組平行，將各組同時放入轉速為180 r/min的搖床中，5 h后測定D600 nm[11]。

1.7 生理生化反應

在3 mL LB液體試管中過夜培養固氮菌。取1套生理生化管，用砂條割開后，在每根生理生化管中均滴入3滴菌液，置于轉速為180 r/min的恒溫搖床中，24 h后觀察各管反應前后的顏色變化。

1.8 數據分析

在最適溫度和最適pH值的篩選試驗中，先對每組3個平行樣取平均值，再根據平均值用Excel作出柱形圖。

2 結果與分析

2.1 2株菌株的形態特征

以江蘇師范大學的校園土壤為樣品，在以葡萄糖為唯一碳源的Ashby培養基上培養并篩選得到2株固氮菌，分別命名為菌株610、菌株611。其中菌株610的菌落形態為圓形、無色透明、邊緣整齊、表面光滑、濕潤凸起，而菌株611的菌落形態為卵圓形、較小、呈乳白色、表面濕潤、邊緣較整齊、中間隆起、含有菌絲。如圖1、圖2所示，經革蘭氏染色并在油鏡下觀察發現，菌株610為短棒狀，菌株611為圓球狀，兩者都呈“8”字形，且呈現紅色，進一步證明本研究分離的固氮菌屬于革蘭氏陰性菌，如圖1、圖2所示。

2.2 菌株610、611的16S rDNA電泳結果

以提取得到的菌株610、611的全基因組DNA為模板，以27F、1492R為引物，對2株固氮菌的16S rDNA基因進行擴增。由圖3可以看出，所得條帶大約在 1 500 bp 處，且單一明亮。

2.3 菌株610、611的測序結果及系統進化樹的構建

將菌株610、611的16S rDNA PCR反應液純化后送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序，獲得對應序列，再將測序結果提交到模式菌株數據庫（http：//www.ezbiocloud.net/eztaxon/identify）中，檢索與所測菌株序列相近的已知菌株，并用MEGA 7.0軟件繪制系統進化樹。由圖4可以看出，菌株610與Arthrobacter nitrophenolicus（硝基酚類節桿菌）的相似性最高，相似度為99.49%;菌株611與Pseudomonas fulva（黃褐假單胞菌）最為相似，相似度為98.95%。

2.4 菌株610、611最適生長溫度的篩選

溫度對菌株生長的影響較大。由圖5所示，當溫度為15～35 ℃時，隨著溫度的上升，菌株610的D600 nm也不斷升高，到35 ℃時達到最大值;當溫度超過35 ℃后，隨著溫度的繼續升高，D600 nm反而開始下降。因此可見，菌株610的最適生長溫度是 35 ℃。菌株611在30 ℃時的D600 nm明顯高于其他組，因而菌株611的最適生長溫度為30 ℃。

2.5 菌株610、611生長最適pH值的篩選

由圖6可以看出，菌株610可以在pH值為3～11的條件下生長，且在pH值為7時生長得最好，因此菌株610生長的最適pH值為7; 而菌株611在pH值為8時的D600 nm明顯高于其他組，因此菌株611生長的最適pH值為8。

2.6 菌株610、611的部分生理生化特征

用微量生化反應管對固氮菌菌株610、611的部分生理生化特征進行分析，將培養好的菌液注入用砂條割開的生理生化管中培養24 h，觀察其顏色變化。由表2可以看出，菌株610僅能利用部分多糖物質，如果糖、蔗糖、D-核糖等，同時能利用一些氨基酸和有機酸，如賴氨酸、鳥氨酸、精氨酸、丙二酸鹽等。而菌株611能利用大部分多糖物質，如果糖、蔗糖、麥芽糖、棉籽糖、山梨糖、鼠李糖等，同時能利用賴氨酸、鳥氨酸、精氨酸等氨基酸;此外，菌株611可以利用部分有機酸，如尿素、丙二酸鹽等。

3 討論

關于從土壤中分離固氮菌的報道已經有很多。本試驗從江蘇師范大學校園土壤中成功分離出2株固氮菌，經鑒定，這2株菌均為革蘭氏陰性菌，其中菌株610生長的最適溫度為35 ℃，最適pH值為7;菌株611生長的最適溫度為30 ℃，最適pH值為8。對2株菌株的16S rDNA測序結果進行分析可知，菌株610與Arthrobacter nitrophenolicus的相似度為99.49%，菌株611與Pseudomonas fulva的相似度為98.95%。固氮菌的研究發展對農、林、牧、環境保護及能源利用等有著十分重大的理論和實際意義，然而目前科研人員進行的生物固氮研究主要集中在共生固氮菌如根瘤菌上，關于其他類型固氮菌的基礎研究水平還需提高。

本試驗對固氮菌進行了分離與鑒定，僅完成了基礎的篩菌試驗，若要進一步研究固氮菌，還需對其固氨酶的活性進行檢測，確定有無固氮活性及其活性大小[12]。隨著生物科學技術的發展，基因工程技術已被廣泛應用，科研人員正在研究用基因工程技術將固氮基因轉移從而使植物提高固氮效率，同時也在建構新的固氮微生物，開辟新的研究方向，發展前景非常廣闊[13]。

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