單核釕配合物的合成、表征及抗腫瘤活性研究

張 燕，賈士芳

（太原科技大學 化學與生物工程學院，太原030021）

癌癥是威脅人類健康的主要問題之一，所以研究其作用機理，尋找新的治療方法和高效低毒的抗腫瘤藥物一直是科學家們熱衷研究的前沿課題［1-4］。自從順鉑作為第一個抗腫瘤藥物后［5］，小分子金屬配合物作為抗腫瘤藥物的研究便引起了人們極大的興趣［6］。繼金屬鉑配合物之后，發現一些釕的配合物也有較高的抗腫瘤活性，如NAMI和KP1019，其中KP1019型釕金屬配合物現已進入臨床Ⅰ期，其對Lewis肺癌和原發性直腸癌有明顯抑制作用［7-8］。NAMI對肺癌非小細胞的研究已進入Ⅱ期臨床階段［9］。SATYANARAYANA 教 授［10］課 題 組 合 成了三 個含有 ptip［ptip＝ （2-（5-phenylthiophen-2-yl）-1H-imidazo［4，5-f］［1，10phenanthroline］配體的吡啶釕配合物，其對Hela的IC50值依次為21.7，22.4和23.1μmol／L，它們的細胞毒性均與濃度呈線性關系。廣東藥學院劉云軍老師課題組［11］也合成過一組單核釕配合物Ru1～3（結構如圖1），分別測試了它們對A549，BEL-7402，MG-63和SKBR-3四種腫瘤細胞的細胞毒性。其中，Ru3對三種腫瘤細胞表現出比順鉑好的效果。

圖1 Ru1～3的結構式Fig.1 Structure of Ru1～3

希夫堿是含有—CH■ N—結構的一類有機物，因其N原子上連有苯環而比較穩定。此類有機物結構多樣，除含有碳氮雙鍵外，通常還含有羥基等其它可提供孤對電子的基團，使其易與金屬離子形成配合物，而且形成的配合物具有豐富的電子光譜和電化學性質，因此希夫堿及其配合物一直是炙手可熱的研究對象［12-17］。基于這兩點本文將金屬釕與希夫堿配體反應，得到兩個單核釕配合物，通過元素分析、紅外光譜、電噴霧質譜和核磁氫譜對它們進行表征。此外，還對配合物做了紫外-可見吸收光譜和電化學測試。通過體外細胞實驗方法研究了兩個配合物對宮頸癌細胞（Hela）、乳腺癌細胞（MCF-7）和胃癌細胞（BGC823）三種腫瘤細胞的抗腫瘤活性。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

AL204分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；DF-101B恒溫磁力攪拌器（鄭州長城科工貿有限公司）；SHB-Ⅲ循環水式多用真空泵（鄭州長城科工貿有限公司）；PE20005型元素分析譜儀（美國PE公司）；Varian Mercury VX-300型核磁共振儀（瑞士Bruker公司）；Nicolet38型傅立葉紅外光譜儀（thermo electron corporation）；TU-1901紫外-可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；CHI630E型電化學工作站（上海辰華儀器有限公司）；EPICS XL-MCL型酶標儀（美國 Beckman Coulter公司）；EPICS XL-MCL型流式細胞儀（美國Beckman Coulter公司）。

三水合三氯化釕、2，2′-聯吡啶（bpy）、4，4′-二氨基二苯硫醚、2-吡啶甲醛、硼氫化鈉、氘代三氯甲烷、氘代二甲基亞砜等均為市售分析純試劑，購于武漢申試化工有限公司，所有試劑都未經純化直接使用。使用的水為蒸餾水。胎牛血清購自美國Gibco公司。

1.2 目標化合物的合成

1.2.1 合成路線圖

配體及配合物的合成路線見圖2.

1.2.2 配體及配合物的合成

配體L1的合成：稱取4，4′-二氨基二苯硫醚1.08g（5mmol），2-吡啶甲醛1.30g（12mmol），溶于25mL甲醇溶液中，加熱回流4h.反應結束后，將溶液冷卻過濾，濃縮至干得油狀物，用二氯甲烷處理產物，得黃綠色固體粉末，用乙醚多次洗滌，真空干燥，得產物1.83g，產率93%.分子式：C24H18N4S.元素分析實驗值（%）：C 73.07，H 4.59，N 14.25；計算值：C 73.10，H 4.57，N 14.21.1H NMR（300 MHz，CDCl3）：8.72（d，J＝4.2Hz，2H），8.61（s，2H），8.20（d，J＝7.9Hz，2H），7.82（t，J＝7.1Hz，2H），7.42（m，4H），7.28（m，6H）.IR（KBr，cm-1）：，1 563，1 476，1 432，199，1 018（vPh—S），826，769，730（δC—H）.

配體L2的合成：稱取配體L10.40g（1mmol），硼氫化鈉0.10g（2.5mmol），溶于25mL甲醇中，加熱回流4h，將產物濃縮至干，用乙醚多次洗滌，真空干燥，得淺黃色固體粉末0.33g，產率82.9%.分子式C24H22N4S.元素分析實驗值（%）：C 72.39，H 5.49，N 14.11；計算值：C 72.36，H 5.53，N 14.07.1H NMR（300MHz，CDCl3）：8.57（d，J＝4.3Hz，2H），7.64（t，J＝7.6Hz，2H），7.36（m，4H），7.11（d，4H），6.58（d，J＝8.4Hz，4H），4.85（s，2H），4.43（s，4H）.IR（KBr，cm-1）：3 378（vN—H），1 596，1 499，1 426，1 316（vC■C，vC■N，vC—N），1 083，1 043（vPh—S），823，752（δC—H）.

圖2 配體及配合物的合成路線Fig.2 Synthesis of the ligand and Ru complexes

配合物Ru1的合成：稱取0.52g（1mmol）二水合二氯二聯吡啶釕，0.35g（2.1mmol）硝酸銀于250mL燒瓶中，加入100mL乙醇溶解，加熱回流2 h，趁熱過濾，除去氯化銀沉淀，得到紅棕色溶液。稱取0.4g（1.0mmol）配體L1于250mL燒瓶中，將所得到的濾液加入燒瓶中，溶液在N2保護下回流12h.反應結束后，將溶液濃縮除去大量溶劑，將產物倒出，加入少量飽和高氯酸鈉乙醇溶液，產物逐漸沉降出來，過濾，用乙醚洗滌，真空干燥。所得固體用少量的乙腈溶解，以乙腈和水混合溶劑作為洗脫劑（體積比24∶1），氧化鋁裝柱進行柱分離，將收集的產物濃縮至干，真空干燥后，得棕色固體粉末0.31g，產率62.5%.配合物 Ru1的分子式為C44H34Cl2N8O8RuS.元素分析實驗值（%）：C 52.51，H 3.35，N 11.15，計算值：C 52.49，H 3.38，N 11.13.1H NMR（300MHz，DMSO-d6）：8.88（d，4H），8.79～8.74（m，6H），8.60～8.19（d，8H），7.99～7.64（t，6H），7.50（s，1H），7.30（d，4H），7.03～6.62（m，5H）.IR（KBr，cm-1）：1 627（vC■N），1 593，1 441（vC■C，vC■N），766，622（δC—H），1 092（vCl—O）.ESI-MS（m／z）：計算值為403.500 0，實際測得值為404.300 0，此峰歸屬為Ru12＋.

配合物Ru2的合成：合成方法及步驟同Ru1，換用配體L20.21g（0.5mmol）代替 L1，得到紅褐色固體0.26g，產率51.4%.配合物Ru2的分子式為C44H38Cl2N8O8RuS.元素分析實驗值（%）：C 52.25，H 3.75，N 11.12，計算值：C 52.28，H 3.76，N 11.09.1H NMR（300MHz，DMSO-d6）：8.85（d，4H），8.60～8.36（m，6H），8.24～8.09（m，4H），7.93～7.74（dd，J＝17.8，11.8Hz，6H），7.66～7.46（m，3H），7.28（t，J＝12.2，10.8Hz，4H），7.01（d，J＝8.5Hz，4H），6.50（d，J＝8.6Hz，4H），4.32（d，J＝3.8Hz，3H）.IR（KBr，cm-1）：1 596，1 502，1 435（vC■C，vC■N），758，625（vC—H），1 086（vCl—O）.ESI-MS（m／z）：計算值為406.100 0，實際測得值為405.000 0，此峰屬于Ru22＋.

1.3 生物活性檢測

按照標準的 MTT測試方法［18-19］進行檢測，概括為4步：

1）種入細胞。在96孔板的3～11列用排槍分別加入懸有細胞的200μL培養基，使每孔細胞數大約為10 000個，第2列作為溶劑空白，96孔板周圍加培養基防止揮發。將96孔板放入37℃，5%CO2的培養箱中過夜，觀察細胞生長情況，待80%細胞貼壁后，進行下一步。

2）加藥。在24孔板的每個孔中各加入3mL培養基，將所加藥物稀釋到不同濃度梯度，用排槍將孔中原有的培養液吸掉，每一列加入相同濃度的藥物，加完后，放入培養箱培養48h。

3）加 MTT.在藥物與細胞相互作用結束前4h，吸掉培養液，用緩沖溶液PBS洗滌兩次，然后每孔加入180μL PBS緩沖溶液，再加入20μL 5mg／mL的MTT，放入培養箱繼續培養4h.

4）加DMSO.4h后拿出96孔板，吸掉上清液，每孔加入150μL DMSO，放入搖床內搖10min，將紫色結晶物充分溶解，放入酶標儀卡槽內在490 nm波長處掃描，得到吸光度值（OD值）。吸光度值可以間接的反應活細胞的數量，以此來計算IC50值：

IC50＝OD（實驗組）／OD（對照組）. （1）

1.4 流式細胞儀檢測細胞凋亡

流式細胞儀檢測Ru1誘導腫瘤細胞凋亡使用的熒光探針是Annexin V-FITC和PI.Ru1處理MCF-7細胞24h，同時做一個Ru1未處理的MCF-7細胞作對照，分別收集細胞數目達到105個，用滅菌PBS緩沖液洗滌一次后，每管加入500μL試劑盒中的結合緩沖液并重懸細胞。每管分別加10μL PI染液和5μL Annexin V-FITC染液，避光染色5 min，使用EPICS XL-MCL型流式細胞儀檢測細胞凋亡，使用488nm分別激發出FITC的綠光和PI的紅光。樣品上儀器前用200目濾網過濾雜質以免堵塞機器。使用儀器自帶的EXPO32MultiComp（Beckman Coulter）軟件自動擬合出各時期細胞凋亡率和壞死率。

1.5 Hoechst 33258染色測定細胞凋亡

蓋玻片放入6孔板內，細胞培養過夜，大約50%～80%鋪滿細胞。用各個濃度的藥物（5，10，25 μmol／L）處理細胞24h，吸盡培養液，加入0.5mL含4%多聚甲醛或70%乙醇的固定液，固定10min或者更長時間。棄掉固定液，用PBS洗兩遍，每次3 min，吸盡液體。加入1mL 10μg／mL的 Hoechst33258染色液，37℃染色15min.棄去染色液，用PBS洗兩遍，每次3min，吸盡液體。熒光顯微鏡下用紫外光激發，可觀察到呈藍色的細胞核，根據細胞核是否皺縮來判斷細胞凋亡情況。

2 結果與討論

2.1 配體及配合物的合成

配體及配合物是按照相關文獻合成的［20］，為了確定配體及配合物的結構，在CDCl3和DMSO-d6溶劑里做了核磁氫譜。以配體L1為例（如圖3），8.72處為吡啶環上H6的峰，該峰屬于雙重峰，由于受鄰位氮原子的吸電子效應影響，使得吡啶環中該氫的化學位移最大；8.61處為希夫堿—CHN—上H5的峰，該峰是一個強的單峰，由此可判斷配體中形成了希夫堿鍵；8.20處為吡啶環上H4的雙重峰；7.82處為吡啶環中 H3的三重峰；7.42處的峰屬于苯環上H2的峰，為雙重峰；7.28處為多重峰，此多重峰歸屬于苯環上的H1及吡啶環上的H1.苯環上H2的峰相比H1移向低場，由于H2受希夫堿鍵吸電子效應的影響，使得去屏蔽作用增強，所以移向低場。同樣L2和Ru1、Ru2也分別在CDCl3和DMSO-d6溶劑里做了核磁氫譜，很明顯L2配體的1H NMR中8.61×10-6附近的單峰消失了，說明希夫堿鍵被還原為單鍵。對配合物來說，因其分子中苯環較多，氫化學環境相差不大，使得峰相互疊加，難以一一指認。但是測得的圖譜中總氫的個數與化學結構式中氫的個數一致。說明配體和配合物在溶液里能穩定存在。

圖3 配體L1在CDCl3中的核磁氫譜Fig.3 1 H NMR of ligand L1 in CDCl3

2.2 光譜性質

將配合物配制成濃度為1.0×10-5mol／L的乙腈溶液，測試配合物的紫外-可見吸收光譜，如圖4所示。配合物Ru1在254，286和487nm處有三個吸收峰，而配合物Ru2在278和484nm處有兩個吸收峰。其中254，286和278nm三個峰屬于配體內π-π＊躍遷產生的吸收峰；487和484nm處的吸收峰屬于金屬到配體的電荷轉移吸收峰（MLCT），相比［Ru（bpy）3］2＋（λmax＝451nm）發生了略微的紅移，說明所合成的配合物共軛體系比［Ru（bpy）3］2＋大［21-22］。

圖4 Ru1和Ru2在乙腈中的紫外-可見吸收光譜Fig.4 UV-Vis spectra of complexes Ru1and Ru2（1×10-5 mol／L）in acetonitrile

2.3 電化學性質

將 Ru1和 Ru2分別溶解在0.1mol／L的Bu4NClO4的乙腈溶液中配制成一定濃度（1.0×10-3mol／L）的溶液，以鉑電極為工作電極和對電極，飽和甘汞電極（SCE）作為參比電極，組成簡單的三電極體系通過微分脈沖極譜法測試配合物的氧化還原電位，得到微分脈沖極譜曲線（DPV），如圖5所示。從圖5可以看出，兩個配合物在0～1.5V范圍內均有兩個氧化峰，而配體在0～1.5V范圍內沒有氧化峰，說明這兩個峰是金屬中心的氧化峰，分別對應于Ru2＋→Ru3＋→Ru4＋.

圖5 Ru1和Ru2在乙腈中的微分脈沖極譜曲線Fig.5 Differential pulse voltammetry studies of Ru1and Ru2in acetonitrile

2.4 生物活性檢測

通過MTT方法檢測配合物對Hela（人宮頸癌細胞）、BGC823（胃癌細胞）和 MCF-7（乳腺癌細胞）的細胞毒性。作出Ru1和Ru2對三種腫瘤細胞作用48h后的濃度-存活率曲線圖。圖6顯示了Ru1和Ru2對Hela、BGC823和MCF-7的細胞毒性結果。從表1和圖6可以看出，對不同的腫瘤細胞，Ru1的IC50值都比Ru2小，說明Ru1的抗腫瘤活性大于Ru2.而對所測的三種細胞，Ru1和Ru2均對MCF-7的IC50值最小，說明兩個配合物對 MCF-7有比較好的選擇性，可能成為潛在的抗癌藥物。機理可能是配合物的溶解度低，疏水性強，親脂性大，使得配合物容易累積到線粒體內。釕配合物作為抗腫瘤藥物的具體機理還在進一步研究中。

圖6 Ru1和Ru2對腫瘤細胞的濃度-存活率曲線圖Fig.6 Cell viability of Ru1and Ru2toward proliferation of Hela，BGC823and MCF-7

表1 Ru1和Ru2的IC50值Table 1 IC50of Ru1and Ru2

2.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡

Annexin-V FITC和PI兩種熒光試劑雙染Ru1處理24h后的MCF-7細胞，再結合流式細胞技術檢測處于各種狀態的細胞（正常細胞、早期凋亡細胞、中晚期凋亡細胞、壞死細胞）的比例。圖7所示是Ru1處理過的MCF-7細胞。當Ru1處理細胞24h后，對照組中正常細胞和早期凋亡細胞的比例分別為93.67%和2.58%.當用5，10和25μmol／L的Ru1處理后，早期凋亡細胞的比例分別為3.11%，4.22%和12.44%.明顯可以看出，隨著配合物濃度的增大，早期凋亡細胞所占比例逐漸增大，說明Ru1會誘導MCF-7細胞凋亡而不是壞死。

圖7 MCF-7細胞中正常細胞、凋亡細胞和壞死細胞的比例Fig.7 Percentage of living（B3），necrotic（B2），and apoptotic（B4）MCF-7cells

2.6 Hoechst染色法檢測細胞凋亡

Hoechst是一種熒光染料，它的膜通透性很好，正常細胞和早中期凋亡的細胞可以被Hoechst著色。正常細胞核被它染色后的形態是圓形，淡藍色，里面有較深的藍色顆粒，而凋亡細胞的細胞核由于濃集而呈亮藍色，或呈分葉、碎片、邊集狀態。MCF-7細胞經5，10和25μmol／L的Ru1作用24h后，熒光顯微鏡下觀察并拍照。從圖8可見，對照組的細胞呈正常結構，沒有觀察到細胞核固縮，染色質凝聚和塊狀熒光等現象，而配合物作用后的細胞呈現細胞核固縮，染色質凝聚，部分呈月牙形附于核膜周圍，并且隨著配合物濃度的增大，這種不正常的細胞比例逐漸增大，說明Ru1誘導MCF-7細胞凋亡。

圖8 熒光顯微鏡觀察Hoechst33258染色MCF-7細胞Fig.8 Hoechst 33258staining of MCF-7cells

3 結論

本文以4，4′-二氨基二苯硫醚和2-吡啶甲醛為原料，合成了兩個配體，并在此基礎上合成了兩個單核釕配合物。通過元素分析、核磁氫譜、紅外光譜、電噴霧質譜對配體及配合物進行了結構表征，證實了配合物結構的正確性。此外，研究了配合物的紫外-可見吸收光譜和電化學性質。通過MTT法測試了Ru1和Ru2對Hela、BGC823和MCF-7三種腫瘤細胞的抗癌活性。結果顯示：Ru1的抗腫瘤活性強于Ru2，說明含有希夫堿結構的配合物與腫瘤細胞作用較強。而在所測的三種細胞中，Ru1和Ru2均表現出對MCF-7有很好的選擇性，說明Ru1和Ru2可能成為治療癌癥的潛在藥物。最后通過熒光染色法和流式細胞儀檢測配合物Ru1對MCF-7的細胞凋亡，實驗結果表明Ru1誘導腫瘤細胞凋亡。