腐殖土與解磷微生物協同改良堿性土壤有效磷的研究

祁 彧，張艷榮，張 弛，張衛珂

（太原理工大學 環境科學與工程學院，太原030024）

磷是植物生長所必需的營養元素之一。土壤磷以無機態和有機態存在，其中有效磷占土壤全磷量的25%～70%左右［1］。隨著常規磷肥的盲目使用、水土流失及磷酸鹽類自身化學轉化，大量磷素以無效態儲存，并帶來了農業的面源污染、水體的富營養化及改變土壤生物多樣性等問題［2-3］。因此，尋求改良土壤中有效磷的途徑和方法，對農業生產的可持續發展和生態環境問題的改善具有重要意義。磷在堿性土壤中的轉化過程以吸附-解吸為主，其影響因素主要有pH值、鈣、鐵鋁氧化物、有機質等［4］。首先，堿性土壤中因含有大量的HCO-3而具有較高的pH值，并具有較大的緩沖性，對磷的固定能力很強［5］，土壤pH接近中性時，磷的有效性才能達到最高［6］。已有研究表明低分子量有機酸、酸性物質（磷酸二氫銨、硫磺等）和生物酸性肥料均可通過改變土壤的pH值，對土壤養分有效性產生影響［7-9］。此外，通過施用有機肥料也可促進土壤有效磷含量的提高［10-11］。研究證實，腐殖土可提供大量有機質（以腐殖酸為主），能改善土壤基質的疏松度、提高孔隙度，有利于根系擴展，還能為微生物活動提供碳源［12］。目前市場中生物磷肥占比較少，溶磷微生物種類繁多，菌種獲得的難易程度不一［9］，與有機肥料混合施用方面鮮有報道。基于此，本文根據醋酸桿菌具有耐高溫、耐乙醇、高產酸（乙酸），且已在發酵等行業廣泛應用等特點［13］，將其作為解磷菌種與腐殖土共同施入堿性土壤，通過土培試驗對比分析二者混合施用與常規磷肥對土壤有效磷的影響差異，以期為解決目前磷素利用率偏低及大量流失造成的污染等問題提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料采集與制備

1.1.1 供試土壤

土壤采樣點選擇呂梁山地區，該地區土壤類型以褐土為主，采樣深度為0～10cm.經測定樣品pH值為8.5，呈弱堿性，有效磷（AP）和全磷（TP）含量分別為15.82mg／kg、732.41mg／kg.采集后實驗室內在45℃下烘干處理5d，混合過10目篩備用。

1.1.2 醋酸桿菌菌液（AS）制備

將醋酸桿菌菌種接種至瓊脂培養基（酵母膏：2%，葡萄糖：1.5%，瓊脂：1.5%，乙醇：3%，均為質量分數；pH：5.5～6.0），30℃下培養36h；之后接種至搖瓶中80mL液體培養基（酵母膏：2%，葡萄糖：1.5%，KH2PO4：0.45%，乙醇：3%，pH：5.5～6.0），進行振蕩培養（轉速180r／min，溫度30℃，20h），獲得醋酸桿菌種子液。將巨型球菌屬接種至牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基（牛肉膏：0.3%，蛋白胨：1%，NaCl：0.5%，瓊脂：2%，均為質量分數；pH：5.5～6.0），30℃下培養48h；之后接種至80mL肉湯液體培養基（與肉膏蛋白胨瓊脂培養基一致，但不添加瓊脂）上振蕩培養（180r／min，30 ℃，36h），獲得巨型球菌種子液。將不同種子液加入由植物殘體、酸堿調節劑和水組成的發酵罐中繼續室溫發酵30d得到AS。

1.2 檢測方法

土壤全磷含量采用鉬銻抗比色法（GB 9837-88）；有效磷含量采用碳酸氫鈉提取法（NYT 1121.7-2014：7）.

1.3 試劑與儀器

本文中所有試劑均為分析純。碳酸氫鈉、磷酸二氫鉀、碳酸鈉、氫氧化鈉購自國藥集團化學試劑有限公司；鉬酸銨、濃硫酸、酚酞、鹽酸、酒石酸銻鉀、抗壞血酸、2，6-二硝基酚購自天津市化學試劑四廠；磷肥與腐殖土購自山西天脊煤化工有限公司，參數見表1.

表1 磷肥與腐殖土參數Table 1 Relevant parameters of phosphate fertilizer and humus soil

采用美國康塔儀器微生物培養箱進行醋酸桿菌菌液的制備；UV-2102PC紫外可見分光光度計（上海尤尼柯）測定土壤TP、AP含量；NICOLET iS10傅里葉紅外光譜儀（美國）鑒定菌液中基團類型。

1.4 土培試驗

采用培養罐分裝土壤（210g／罐），共設計11組土培樣品，每組3個平行，取樣時間分別為1、7、30、60、90d.添加劑延土壤垂向表層（記為0）與3cm（記為3）兩種深度分別施用，試驗用量為 HS：400 g／m2（即2.27g／jar）；肥料：40g／m2（即0.23g／jar）；AS：1mL／jar（去離子水稀釋菌液至10mL）.試驗過程中保持土壤含水率在15%左右。樣品分組情況見表2.

表2 土培樣品處理組Table 2 Treatment groups for soil culture samples

2 結果與討論

2.1 醋酸桿菌菌液表征

2.1.1 FTIR分析

由圖1可知，645cm-1的強吸收為—OH的彎曲振動，說明溶液中存在醇類物質，這與埃希氏巨型球菌三羧酸循環中產生醇類物質一致；1 644cm-1與3 300cm-1處的強吸收對應單體酸—CO羰基的強銳峰與羧酸中的—OH的吸收峰［14］，這與醋酸桿菌經糖酵解途徑產生乙酸、埃希氏巨型球菌經呼吸作用產生的低分子量有機酸物質一致。說明自制菌液AS中含有機酸類物質與醇類物質。

2.1.2 高通量測序

在屬水平級別對微生物菌液中主要物種（V3-V4區）進行分析（圖2）.

圖1 AS的紅外譜圖Fig.1 FTIR spectrum of AS

圖2 屬水平上菌液中主要rank reads數目Fig.2 Number of main rank reads in AS at the genus level

由圖2看出，醋酸桿菌菌液中Acetobacter占46.58%，Megasphaera占21.6%，即主要為醋酸桿菌屬與埃希氏巨型球菌屬。以醋酸桿菌為例，其代謝有機終產物為乙酸［15］。研究證明在堿性土壤環境下，有機酸可活化Ca-P中的磷，同時酸根與鈣離子絡合，促進難溶性磷素的進一步釋放［16］。因此本文自制菌液可滿足土培試驗解磷要求。

2.2 不同添加劑對土壤有效磷的影響

以第90d測定數據為例說明不同添加劑對土壤有效磷的影響（圖3）.

圖3 土培實驗第90dAP／TPFig.3 AP／TP for soil culture experiments in ninetieth day

由圖3可知，與空白組相比，不同施肥方式均顯著提高了AP組分的含量。其中HA對堿性土壤AP的釋放效果較單施常規磷肥更好（表層處：T2＞T4，3cm處：T3＞T5），即醋酸桿菌菌液與腐殖土共同施用后可有效促進土壤磷的釋放。此結果與二者提供的有機酸（乙酸、腐殖酸等）有關。首先，本文中土壤樣品呈弱堿性，在此條件下土壤磷受到鈣的固定，主要以Ca—P的形式存在，占無機磷總量的80%以上［17］。已有研究表明，有機酸類物質中含有—COOH、—OH等官能團，它們在對某些肥料產生溶解作用的同時，通過占據土壤中陰離子專性吸附位點，與Ca2＋等離子螯合，降低了磷酸根等陰離子的吸附量，使一些被束縛的磷素得到釋放；且有機酸的活化能力與其濃度、有效磷含量呈正相關［18-19］。其次，腐殖酸肥料能夠調節土壤的pH值向中性方向發展，有益于土壤微生物生長，并激發其活性；同時可以有效降低土壤容重，增加土壤孔隙率，改善土壤的物理性質，提高有機質和其他速效養分的含量［20］。

此外，由圖3也可看出，大部分施用腐殖土肥料樣品中AP含量呈現出3cm處＞表層，可能原因為腐殖土中的有機質（腐植酸）間相互作用產生的絮狀現象改善了土壤的團粒結構，使土壤的透水性提高，徑流減少，剖面養分增加，有利于磷素發生交換吸附反應，從而提高了其在土壤中的移動性與有效性［21］。由于本文土培試驗設計土層厚度較小，施肥深度與均勻度與田間施肥有較大差異，后續需要根據實際農田環境及種植作物等情況進一步深入探討。

2.3 施肥時間對土壤有效磷的影響

圖4、圖5分別為土壤表層與3cm深處不同肥料施用后AP含量的變化。首先由圖可以看出，T2、T3（腐殖土與醋酸桿菌液）處理組中AP變化趨勢為0～30d內小幅下降，在第30d左右達到最低值；30d后含量提高，在第90d達到最大值，較剛施入時分別 增 加 10.23% （表層）、12.86% （3cm處）；較空白組分別增加38.69%（表層）、37.83%（3cm處），即與空白組相比，差異達到顯著水平（P＜0.05）。劉勝亮等［22］通過將4種可產出乙酸的解磷細菌（不動桿菌、腸桿菌等）施入土壤后發現，土壤pH值在30～120d內呈逐漸降低趨勢；AP含量在30d時較第1d有所下降；接種90d后，較60d有明顯增長，該結果與本文試驗結論基本一致。

圖4 施肥時間對表層處（T1、T2、T4、T6）土壤有效磷的影響Fig.4 Effect of fertilization time on available phosphorus（AP）on the surface layer of the soil（T1，T2，T4，T6）

圖5 施肥時間對土層3cm處（T1、T3、T5、T7）有效磷的影響Fig.5 Effect of fertilization time on available phosphorus（AP）in 3cm deep of the soil layer（T1，T3，T5，T7）

另外，T4-T7組AP含量在磷肥剛施入土壤時（0d）達到最大，之后基本處于下降趨勢。在第90 d時，不同處理組各層AP含量關系為T2＞T6＞T4＞T1（表層）、T3＞T5＞T7＞T1（3cm），即 HA處理方式對土壤中難溶性磷的溶解優于常規磷肥。該現象反映出土壤單純施用磷肥后，肥料磷更多地被土壤吸附，降低了磷素的有效利用，造成資源浪費［23］。

圖6、圖7中T8-T11曲線變化規律同T4-T7，即將磷肥與HA混合施用后，土壤AP含量在90d內基本處于下降趨勢。不同之處在于0～90d范圍內，T8-T11處理組在土壤各層AP含量均要高于HA處理組，說明外源磷素的引入使土壤TP含量增加，HA中有機質組分能進一步促進磷肥中的磷素解吸，從而提高了AP的含量。由此可以證明，在磷素水平較低的堿性土壤中，可同時施加HA與磷肥，使各形態磷素含量提高［24］。

此外，圖4-圖7中也顯示出無論單獨還是混合HA后施用硝酸磷鉀肥對于AP含量的提高都優于硝酸磷肥，原因可能為肥料中更多的K＋（KCl、K2SO4）及NH＋對土壤固相表面H＋的交換作用，使土壤pH值下降，從而顯著增加了AP的含量［17］。

圖6 施肥時間對表層處（T1、T2、T8、T10）土壤有效磷的影響Fig.6 Effect of fertilization time on available phosphorus（AP）on the surface layer of the soil（T1，T2，T8，T10）

圖7 施肥時間對土層3cm處（T1、T3、T9、T11）有效磷的影響Fig.7 Effect of fertilization time on available phosphorus（AP）in 3cm deep of the soil layer（T1，T3，T9，T11）

3 結論

為了探討腐殖土與解磷微生物協同作用下對堿性土壤有效磷（AP）的影響，本文共設計了11組土培對比試驗（90d）.結果顯示，HA（腐殖土＋醋酸桿菌菌液混合施用）對AP的改善優于常規磷肥；在磷素匱乏土壤中，HA與常規磷肥混合施用更有利于促進AP含量的提高。推測HA對AP的影響機理為：腐殖土富含有機質（以腐殖酸為主），在改善土壤質地的基礎上，能為菌液中微生物的代謝活動提供碳源；而醋酸桿菌等菌種能產生出低分子量有機酸，可與腐殖酸共同作用，有效降低堿性土壤的pH值，使土壤磷的形態發生改變，促進難溶磷的溶解。下一步研究可采用更多種類有機肥料，并結合田間試驗，使結論更具普遍性。