寧夏甜瓜白粉病室內苗期抗病性鑒定方法及抗性種質資源篩選

王祿星，王曉敏，2，3，宋建宇，張雪艷，2，3，田 梅，于 蓉

（1.寧夏大學農學院 銀川 750021； 2.寧夏現代設施園藝工程技術研究中心 銀川 750021；3.寧夏優勢特色作物現代分子育種重點實驗室 銀川 750021； 4.寧夏農林科學院種質資源研究所 銀川 750002）

甜瓜白粉病是一種廣泛發生的世界性氣傳病害，已成為瓜類作物綠色生產的主要障礙之一[1]。該病從苗期到成株均可發生，但進入中后期最為嚴重，主要危害葉片，嚴重時亦可危害葉柄和莖蔓[2]。在發病期白粉病菌呈指數增長且迅速傳播，使植株葉片大面積枯死，導致甜瓜產量和品質急劇下降，造成重大經濟損失[3]。

甜瓜產業是寧夏回族自治區“1+4”特色優勢產業之一。近年來，寧夏甜瓜產業集約化、規模化效益顯著，栽培總面積超過8.6 萬hm2，種植規模和影響力在全國尤為突出[4]。但隨著種植面積的擴大，露地及設施甜瓜白粉病危害日益嚴重。種植抗病品種是防治甜瓜白粉病的最經濟、有效、環保、可持續的措施[5-6]。而篩選和培育抗白粉病的甜瓜品種需要科學、簡便、精準的抗性鑒定技術體系。因此，開展甜瓜白粉病抗病性鑒定方法研究，以及篩選優質抗源，對于開展甜瓜抗白粉病育種至關重要。雖然前人對于甜瓜白粉病室內苗期抗性鑒定的苗齡[7-9]、孢子懸浮液濃度[10-11]、接種方法[7-8]等因素都分別進行研究，但均以單因素試驗設計為主，以上幾個因素之間存在的交互作用卻被忽視，造成研究結果一致性較差，且接種白粉病菌后的保濕時間這一因素尚未在甜瓜上進行研究，所以以上接種方法并不能成為甜瓜白粉病抗病性評價通用的最佳鑒定方法。

因此，筆者以前人對室內苗期抗病性鑒定方法單因素研究篩選的最佳結果為基礎，選擇苗齡：2 葉1 心、3 葉1 心和4 葉1 心；孢子懸浮液濃度：104個·mL-1、105個·mL-1和106個·mL-1；接種方法：噴霧法、摩擦法和刷葉法；接種后保濕時間：12 h、24 h 和36 h；采用四因素三水平（L9（3）4）正交試驗設計篩選甜瓜白粉病室內苗期抗病性鑒定方法，并通過篩選出的最佳方法對23 份甜瓜種質資源進行苗期白粉病抗性評價及田間自然發病評價，然后對甜瓜抗性種質資源進行綜合評價，以期為有效開展寧夏甜瓜白粉病防治與白粉病抗病育種提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 甜瓜白粉病病原樣本 于2017 年5 月從寧夏銀川市溫室內發病的甜瓜病株上隨機采集的白粉病病葉上分離出的甜瓜白粉病菌（Podosphaera xanthii）作為病原樣本。

1.1.2 甜瓜種質資源 23 份甜瓜種質資源由寧夏大學農學院園藝課題組和寧夏農林科學院種質資源研究所提供。具體來源信息詳見表1。其中，‘中原新羊角蜜’為感病對照品種，‘抗病F-3800’為抗病對照品種。

表1 23 份甜瓜種質資源品種信息

1.2 方法

1.2.1 白粉病病原菌的分離純化與擴繁 將采集的甜瓜白粉病病葉樣本先用無菌水洗掉表面灰塵，然后用軟毛刷將病菌孢子刷入含0.05%吐溫-20 的無菌水中，充分震蕩，用血球計數板鏡檢計數，制成約1×105個·mL-1孢子懸浮液，詳見王萍等[11]的方法。用刷葉法接種到寧夏大學農科實訓基地溫室盆栽種植的感病甜瓜‘中原新羊角蜜’的葉片上。待葉片發病后，于發病初期通過單病斑分離、純化白粉病菌，經鑒定后，再進行擴繁與保存[8]。

1.2.2 室內苗期抗病性鑒定方法正交試驗 試驗于2017 年5—9 月在寧夏大學農科實訓基地溫室進行，以室內盆栽種植的‘中原新羊角蜜’為試驗材料，對苗齡（A）、孢子懸浮液濃度（B）、接種方法（C）[9]、保濕時間（D）采用四因素三水平（L9（3）4）的正交試驗設計，從而進一步優化甜瓜白粉病室內苗期抗病性鑒定方法，設計因素和水平詳見表2～3。每個試驗處理3 次重復，種植3 個口徑為15 cm、高13.5 cm 的育苗缽，每個育苗缽種3 株幼苗。

接種后7 d 開始觀察記錄發病情況，接種后15～20 d 病情充分發生并穩定后調查發病率和病情指數，分級標準按照《中國蔬菜病蟲預測預報》的方法[12]，詳見表4。病情指數（DI）＝∑（各級病株數×各級代表值）/（調查總株數×最高級代表值）×100[12]。以病情指數最高的方法為最優的鑒定方法。

表2 甜瓜白粉病苗期抗性鑒定試驗因素與水平

表3 甜瓜白粉病苗期抗性鑒定實施方案

表4 室內苗期抗病性鑒定病情分級標準

1.2.3 甜瓜種質資源的室內苗期抗病性鑒定 采用1.2.2 中篩選的最佳的室內苗期抗病性鑒定方法于2018 年6 月對23 份種質資源材料進行抗病性鑒定，每份材料種植3 個育苗缽，每個育苗缽種植5株幼苗。設計完全隨機試驗，發病率和病情指數的調查詳見1.2.2。最終根據病情指數，對23 份甜瓜種質資源進行抗感分級[13]，詳見表5。

表5 甜瓜白粉病抗感分級標準

1.2.4 甜瓜種質資源的田間自然發病抗病性調查 23 份甜瓜種質資源于2018 年3—7 月種植在寧夏農林科學院種質資源研究所園林場大拱棚中，半高壟雙行栽植，壟高20 cm，畦寬90 cm，溝心距1.5 m，株距35 cm，小區面積24.75 m2（5.5 m×1.5 m×3 m）。在甜瓜成熟期前10 d（白粉病發病相對穩定），每個種質資源隨機選取10 株，每株隨機選取3片葉進行田間抗病性調查，病情指數和抗感分級標準同室內苗期抗病性鑒定。

1.2.5 數據處理 本試驗所測數據全部采用Excel 2010 處理并作圖，同時利用SPSS 20.0 進行試驗數據方差分析。

2 結果與分析

2.1 基于正交試驗設計的室內苗期抗病性鑒定方法篩選

接種后15 d，感病甜瓜‘中原新羊角蜜’充分發病。首先對單個因素直觀分析，從圖1-A 可知，3 葉1 心和4 葉1 心的發病率無顯著差異，但均顯著高于2 葉1 心；從2 葉1 心到4 葉1 心，隨著甜瓜苗齡的增加，病情指數呈增長趨勢，4 葉1 心的病情指數顯著高于2 葉1 心，與3 葉1 心的無顯著性差異。由圖1-B 可知，隨著孢子懸浮液濃度的增加，發病率和病情指數存在先升高后降低的變化趨勢，不同處理下發病率之間無顯著性差異；105個·mL-1孢子懸浮液接種的病情指數顯著高于104個·mL-1，與106個·mL-1的無顯著性差異。接種方法和保濕時間不同處理之間發病率和病情指數均無顯著性差異（圖1-C 和1-D）。如圖1-E 所示，處理組合8（A3B2C2D3）發病率為100%，且病情指數顯著高于其他8 個處理組合，為70.00，其發病速度適中，病癥明顯，易于調查病害，所以該處理是甜瓜苗期白粉病抗病性鑒定最好的方法，即接種苗齡為4 葉1心，孢子懸浮液濃度105個·mL-1，摩擦法接種，接種后暗保濕36 h。

2.2 23份甜瓜種質資源室內苗期白粉病抗病性鑒定

采用室內苗期抗病性鑒定方法對甜瓜23 份種質資源進行白粉病抗病性鑒定（表6），結果表明，‘15T41’‘中原新羊角蜜’‘15TZH-25’‘15TZH-01’表現為高感（HS），在接種后20 d 的發病率和病情指數較高且之間無顯著性差異，發病嚴重程度依次為‘15T41’＞‘中原新羊角蜜發病’＞‘15TZH-25’＞‘15TZH-01’；‘NT-1’‘日本蘭網’‘15T38’‘15TZH-16’‘15TZH-46’‘15TZH-23’‘15TZH-39’‘TZH-26’表現為中感（MS）；‘15TZH-24’表現為感病（S）；‘天蜜’‘ND-1’表現為抗病（R）；‘玉露’表現為中抗（MR）；‘新密45 號’‘1464’‘綠洲紅’‘Sweet’‘美玉25 號’表現為高抗（HR），其中‘新密45 號’雖然發病率較高，但是病情指數較低；‘抗病F-3800’‘1489’表現為免疫（IM），發病率和病情指數均為0。抗病類型一致的種質資源材料之間的病情指數無顯著性差異。

圖1 室內苗期抗性鑒定方法各組合的抗性鑒定結果（15 d）

表6 23 份甜瓜種質資源室內苗期白粉病抗病性鑒定（接種20 d）

2.3 寧夏地區23 份甜瓜種質資源田間白粉病抗病性調查

如 表7 所 示，‘玉 露’‘天 蜜’‘15TZH-24’‘TZH-26’‘15TZH-39’在田間自然發病條件下的病情指數較室內苗期發病條件下的有所下降，其中‘玉露’表現為高抗（HR）、‘天蜜’表現為中抗（MR）、‘15TZH- 24’表 現 為 抗 病（R）、‘TZH- 26’‘15TZH-39’表現為感病（S），以上材料較室內苗期鑒定結果均提高了抗病類型的一個級別。其他甜瓜材料田間自然發病與室內苗期抗病性鑒定結果一致。綜合室內和田間鑒定結果，23 份甜瓜種質資源中對白粉病免疫的材料有‘抗病F-3800’和‘1489’共2 份（發病率和病情指數均為0），高抗材料有‘新密45 號’‘1464’‘綠洲紅’‘Sweet’和‘美玉25 號’共5 份（發病率低且病情指數均在10 以下）。

表7 23 份甜瓜種質資源田間白粉病抗病性鑒定

3 討論與結論

有效的接種方法是進行病害抗性遺傳分析和抗病育種的基礎。筆者采用正交試驗，通過調查發病率和病情指數，篩選出甜瓜苗期白粉病最佳的接種方法為：在4 葉1 心用105個·mL-1孢子懸浮液摩擦法接種白粉病菌，接種后保濕36 h。張玉勛等[7]發現，厚皮甜瓜苗期白粉病接種以子葉展開時為宜；臧全宇等[8]以不同抗性的甜瓜品種為試材，確定甜瓜2 片真葉期接種可以較好地表現品種之間的差異，同時也指出子葉期和4～5 片真葉期某些材料的苗期抗性會提高；張若緯等[9]通過接種后發病率對比，發現薄皮甜瓜接種苗齡2 葉1 心時為最佳接種苗齡；筆者通過研究4 個因素的交互作用，得出最佳的接種苗齡為4 葉1 心，這可能是因為采用試驗材料抗性不同，或鑒定方法的其他因素互相影響的結果。筆者發現，隨著孢子懸浮液濃度增加，發病率和病情指數呈現低—高—低的變化趨勢，這與張若緯等[9]的研究結果一致。關于苗期抗病性鑒定接種方法的比較研究中，臧全宇等[8]和張若緯等[9]的研究結果均表明噴霧法最佳，王迪等[10]卻認為刷葉法發病率最高，最適宜進行甜瓜白粉病抗病鑒定研究，而筆者在本研究的單因素分析中發現，不同接種方法之間并無顯著性差異，正交試驗的結果為摩擦法最佳，前兩者研究均為單因素試驗設計，未考慮其他接種因素的交互作用對研究結果的影響，推測這是研究結果不一致的主要原因。關于甜瓜白粉病鑒定方法接種后保濕時間的研究未見報道，筆者研究發現最佳保濕時間是36 h，與劉秀波等[14]對南瓜白粉病鑒定的保濕時間一致。此方法為甜瓜白粉病的相關研究奠定基礎。

選育抗病品種是防治甜瓜白粉病最經濟、有效、環保、可持續的措施。筆者以23 份甜瓜種質資源作為試驗材料，采用室內苗期抗病性鑒定方法和田間自然發病病情調查對其進行評價，篩選出抗寧夏銀川地區白粉病菌的甜瓜抗源7 份，其中免疫材料2 份（‘1489’‘抗病F-3800’），高抗材料5 份（‘新密45 號’‘1464’‘綠洲紅’‘Sweet’‘美玉25 號’）。其中‘抗病F-3800’含糖量高、果肉厚，產量高[15]，適合在沙漠日光溫室春茬沙培種植[16]，‘綠洲紅’[15]屬于晚熟品種，產量較高，‘新密45 號’[17]抗寒力弱，建議在寧夏地區設施條件下推廣種植。以上抗性資源可通過與感病品種或品系的雜交與自交分離創新抗病種質，為寧夏選育甜瓜抗白粉病優良品種（系），也有助于對甜瓜白粉病抗性遺傳機制的深入了解。