大白菜苗期根腫病抗性快速鑒定方法

趙艷艷，毛立霞，原玉香，楊雙娟，魏小春，王志勇，牛劉靜，李 林，張曉偉

（河南省農業科學院園藝研究所 鄭州 450002）

十字花科作物根腫病是一種世界性土傳病害，由蕓薹根腫菌（Plasmodiophora brassicaeWoronin.）侵染根部引起的，該菌可在土壤中存活多年，而感病品種都會被這一病原菌侵染。目前，隨著機械農具的使用，根腫病傳播更加迅速，已上升為影響我國大白菜產業發展的主要病害[1]，目前，該病在國內27 個省、自治區、直轄市都有分布[2]，由于長年連作和提早播種，在西南、中部、高山及沿海地區排水不良的酸性土壤中發病更為嚴重。隨著蔬菜集約化育苗的迅猛發展，基質帶菌傳播根腫病的現象在河南新野、安陽、濟源、原陽等地多處發生。根腫病是一種非常難以防治的病害，可導致十字花科蔬菜產量嚴重下降，甚至全面絕收，給菜農造成極大的經濟損失[3]。同時，發生過根腫病的地塊會長期帶菌，無法繼續種植十字花科作物，十字花科作物的可持續生產面臨嚴峻形勢，被稱為是十字花科蔬菜的“癌癥”，還沒有非常有效的解決方法[4-5]。通過化學藥劑灌根拌土、調整土壤酸堿度、添加營養元素以及生防菌等綜合防治手段對根腫病有一定的緩解作用，但是費工費時，土壤板結、經濟效益差、污染環境、成本高等缺點不符合國家蔬菜產業技術政策，而選育抗病品種是從根本上解決該病困擾最安全、經濟有效的方法[4-9]。因此，首要任務是探究一種準確可靠、簡單有效的鑒定方法。

目前，關于十字花科蔬菜抗根腫病品種鑒定已有相關報道，研究表明，大田和室內抗病品種篩選是比較普遍的2 種鑒定方法，接種根腫菌后需要30～40 d 才能夠進行抗感情況調查，這2 種方法只適合少量品種篩選[10]。如果進行大批量的篩選的話則需要大面積的種植空間，費時費工。而且大田和室內鑒定無法觀察到寄主體內根腫菌發生發展情況，因此需要一套更加準確高效、方便快捷、省時省工的篩選方法[11-13]。

大白菜是最易感根腫病的蔬菜品種，目前關于大白菜抗根腫病品種速鑒定方法報道較少，筆者通過對侵染后寄主體根部形態和相關指標統計分析，結合病理學指標和組織結構觀察，旨在為大白菜抗病品種的篩選提出簡單有效、方便快捷及準確可靠的評價依據。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗于2017 年10—12 月在西南大學植物保護學院植物細菌病害研究室進行，試驗材料為經過試驗鑒定為4 號生理小種的河南新野腫根50 g[3]，大 白 菜 品 種‘yx55’‘y510- 9’‘y972’‘y982’‘14CR514M-3’為河南省農業科學院園藝研究所葉類蔬菜研究室自有，其中‘yx55’‘y510-9’為感病品種，‘y972’‘y982’‘14CR514M-3’為抗病品種，抗根腫菌4 號生理小種。‘yx55’‘y510-9’是本研究室多年多次鑒定的根腫病感病材料，分別作為對照處理CK1 和CK2。

1.2 方法

1.2.1 休眠孢子懸浮液的制備 參照毛立霞、朱紅麗等[8，12]的方法并加以改進，把保存的河南新野腫根從冰箱拿出，25 ℃黑暗處理24 h。先在料理機中加入250 mL 無菌水，然后稱取50 g 解凍后切碎后的腫根，間歇性攪拌2～3 min，用8 層紗布將根腫勻漿過濾，把過濾后的液體平均倒入4 個50 mL 無菌離心瓶內，500 r·min-1離心15 min 將上清分別倒入另外4 個無菌離心瓶內；2 500 r·min-1離心5 min 棄上清，留沉淀，無菌水懸浮（重復3～4 次），再加2%氯胺T 溶液25 mL 懸浮，靜置20 min 后2 500 r·min-1離心5 min，用無菌水再次懸浮沉淀重復離心2 次后，用60 mL 無菌水懸浮沉淀，再加入1 μg·mL-1鏈霉素、1 μg·mL-1鹽酸萬古霉素、6 μg·mL-1頭孢塞肟鈉各100 mL 搖勻，25 ℃黑暗處理24 h 后2 500 r·min-1離心5 min，重復離心3 次，最后用無菌水懸浮沉淀混勻后備用[8]。

1.2.2 孢子懸浮液濃度的計算 取10 mL 休眠孢子懸浮液分別稀釋10 倍、100 倍。在25×16 規格的血球計數板分別用移液器滴上1 mL 稀釋過10 倍、100 倍的懸浮液，采用五點法計數3 次孢子數量，計算出休眠孢子懸浮液的濃度，再分別加入1/2 Hoagland營養液母液5、4、1 mL 最后加滅菌水到2 L，把濃度稀釋到1×107個·mL-1[12-14]。調節pH 至5.5（±0.04）。

1.2.3 試驗材料的水培接種 備好滅菌的泡沫篩和10 mL 離心管，用黑色絕緣膠布纏繞離心管，放入10 mL 制備好的接菌液[14-16]。利用水培接種的方法，用直徑15 mm 剪有小口的泡沫篩夾住催芽4 d的寄主苗，露出根部，浸入接菌液中，及時補充1/2 Hoagland 營養液使接菌液保持在10 mL[14-16]。

1.2.4 染色及觀察 分別在接種6、10、14 d 取寄主苗根部觀察根毛和皮層侵染情況[12]。先取根部用FAA 固定液固定24～72 h，固定后用無菌水沖洗掉FAA 固定液，然后用0.5%熒光桃紅染色3 h，沖洗掉熒光桃紅后制片，顯微觀察[12-14]。盡量選浸染部位都一樣的10 個視野觀察，每個視野觀察30 個根毛，每個材料5 個處理，需要觀察1 500 個根毛。分別記錄浸染和未浸染的根毛數。

根毛浸染率/%=（浸染的根毛數/觀察的總根毛數）×100=（浸染的根毛數/1 500）×100。

1.3 數據分析

采用Excel 2016 和SPSS 18.0 統計分析軟件進行數據分析，應用最小顯著差數法（LSD）進行差異顯著性檢驗[8]。

2 結果與分析

2.1 根腫菌侵染根毛的情況

圖1 接種根腫菌后不同品種白菜的根毛結構觀察

如圖1 所示，從圖中可以直觀的看到大白菜品種被侵染的根毛情況，其中被侵染的根毛數最多的是對照組感病品種‘yx55’‘y510-9’，而抗病品種‘y972’‘y982’‘14CR514M-3’被侵染的根毛數則很少。如圖2 所示，圖中2-a 和2-b 分別是未被根腫菌侵染和被侵染的根毛，用熒光桃紅染色后被侵染的根毛中病原菌呈紅色，未被侵染的根毛無色；圖2-c 中能夠清楚的看到根腫菌已經開始侵染根毛皮層；圖2-d 大白菜根毛扭曲嚴重，出現了次生游動孢子排空的情況。隨著侵染時間的增加，5 個試驗大白菜品種根毛的被侵染規律基本一致，皆是先侵染根毛，進而侵染皮層。5 個大白菜品種接菌6 d 后觀察，均有根毛被侵染，侵染率分別為‘yx55’（52.67%）、‘y510-9’（50.00%）、‘y972’（13.53%）、‘y982’（9.47%）、‘14CR514M-3’（13.27%）。接種10 d，與接種6 d 相比，根毛侵染率有所上升，其中感病品種‘yx55’上升幅度最快，達到了75.80%，上升了23.13%，‘y510-9’上升了6.67%；而抗病品種‘y972’‘y982’‘14CR514M-3’根毛侵染率也分別上升了14.67%、14.46%、10.13%。而在接種14 d，‘y972’‘y982’‘14CR514M-3’的根毛侵染率上升緩慢，分別只上升了1%、9.47%、4.33%，侵染率分別為29.67%、33.40%、27.73%，而感病品種‘yx55’和‘y510-9’分別上升了10.2%和30.33%，最終分別達到了86%和87%的高侵染率。‘yx55’和‘y510-9’的根毛侵染高峰時段在10 d 和14 d 之間，‘y972’‘y982’‘14CR514M-3’的根毛侵染高峰時段在6～10 d 之間，如圖3 所示。

圖2 感病品種yx55 根腫菌侵染的根毛動態

圖3 不同品種不同時期根毛侵染率

2.2 根腫菌侵染皮層的情況

如表1 所示，感病對照‘yx55’的皮層侵染數從6 d 觀察到的5 個，增加到10 d 的8 個和14 d 的15 個，‘yx55’的侵染高峰在6～10 d 之間，而且皮層侵染數呈現逐步遞增的的趨勢，在10～14 d 之間增加的數目最多。感病品種‘y510-9’的皮層侵染數從6 d 觀察到的3 個，增加到10 d 的10 個和14 d 的15 個，侵染高峰在6～10 d 之間，而且皮層侵染數呈現逐步遞增的的趨勢，在6～14 d 之間一共增加了12 個。而3 個抗病品種中，只有‘y972’在10 d 觀察時發現有2 處皮層受到侵染，在14 d 觀察時，有3 處皮層侵染，其他品種則沒有被侵染。

表1 不同品種白菜在不同時期的根腫菌侵染皮層的情況標統計分析

2.3 不同品種的根毛侵染率

從表2 數據顯示在接種6 d、10 d、14 d 感病對照‘yx55’‘y510-9’的根毛侵染率與抗病品種‘y972’‘y982’‘14CR514M-3’均有顯著的差異性。特別是在14 d 時，感病品種‘yx55’比抗病品種‘y972’‘y982’‘14CR514M-3’的平均根毛侵染率高52.60%～58.27%；感病品種‘y510-9’比抗病品種‘y972’‘y982’‘14CR514M-3’的平均根毛侵染率高53.60%～59.27%。感病品種之間，除了接種10 d 差異顯著，6 d 和14 d 無明顯差異，而抗病品種之間略有差異，其中‘y982’與‘y972’在接種6 d 和10 d 時就有顯著差異。

表2 不同品種根毛侵染率的顯著差異性分析

3 討論與結論

近年來，十字花科根腫病特別是大白菜、甘藍和油菜根腫病，蔓延非常迅速，發生面積激增，給農戶造成了巨大的經濟損失[3，17-18]。如何準確快捷地鑒定培育的抗病品種是否抗病的需求愈發迫切，行之有效的鑒定手段可以節約大量的人力物力。以往的鑒定一般在大田和溫室進行，但需要空間和時間，效率不高。大白菜接種根腫病菌12 h 后在根毛上即可觀察到初級游動孢子，72 h 后能觀察到皮層侵染，因此，羅延青等[18]選取在甘藍型油菜接種根腫病菌0、12、48 和72 h 共4 個時間點，取材進行早期轉錄組分析，未能進行品種抗性評價。李金萍[19]雖然建立了熒光定量PCR 檢測體系，但是只能對是否帶菌進行檢測，也不能進行品種抗性鑒定。

筆者分別對2 個易感和3 個抗根腫病大白菜品種進行根腫菌接種侵染，通過對寄主根毛進行熒光桃紅染色觀察，發現這5 個品種的根毛均被根腫菌侵染。朱紅麗等[13]的研究表明，白菜根腫病的發病程度取決于根腫菌在寄主根毛和皮層的早期侵染水平。因此選擇了接種后6、10、14 d 進行觀察統計，感病品種‘yx55’和‘y510-9’的根毛侵染率與抗病品種‘y972’‘y982’‘14CR514M-3’差異性顯著。感病品種‘yx55’和‘y510-9’的根毛侵染率6 d 以后逐漸增加，在14 d 時分別達到86.00%和87.00%，而3 個抗病品種的根毛侵染率在10～14 d 漸漸平穩，根毛侵染率在23.40%～33.40%之間，遠遠低于感病品種。因此推測后期根毛浸染率增加幅度較小是由于抗病品種帶有抗源。抗病品種之間略有差異，其中‘y982’與‘y972’有顯著性差異，推測由于抗病品種之間也存在抗性強弱分級的差別，因此不同抗病品種之間根毛侵染率也會存在一定差異，這與田間鑒定結果一致[3,13]。感病品種‘yx55’和‘y510-9’最早被侵入，在6 d 時分別就有5 和3 處皮層侵染，在10～14 d 之間的皮層侵染數增幅最大，達到15 處皮層侵染，這也與根毛侵染率的侵染高峰相符。在抗病品種中，只有‘y972’在10 d 觀察時發現了2 處皮層侵染。在14 d 觀察時就增加了1 處，這也說明了‘y972’的侵染高峰在6～10 d 之間。此結果與毛立霞[8]研究的2 個白菜抗病品種的侵染趨勢一致。但是與朱紅麗等[12]的研究中4 個白菜品種的根毛侵染率呈現為先增后降的動態趨勢有些類似卻存在差異，原因可能是根腫菌生理小種不同致病性和致病程度也不同，不同品種帶有的抗源也會不同，下一步將會對不同的生理小種早期侵染進行研究。且在朱紅麗等[12]的研究中‘早熟長江5 號’‘華良早五號’和‘CR-春美’表現為感病，分別在不同的時間達到侵染高峰，抗病品種CR-英雄根毛侵染率最低。而本研究中根毛侵染率比較低的也是3 個抗病品種，其中接種14 d‘y982’的根毛侵染率最低，且根毛侵染都在6～10 d 達到高峰時段，而感病對照‘yx55’‘y510-9’在10～14 d 根毛侵染達到高峰時段。郭向華[20]通過甘藍品種水培法接種首次觀察到明顯分化的游動孢子囊是在5 d，在13 d 時根毛侵染數達最高峰，與本試驗結果基本一致。

根腫菌侵染植物分2 個階段：初級階段，侵染植物的根毛和表皮細胞；次級階段，根腫菌侵染植物的下胚軸和根的皮層，最后導致宿主發育異常[18，21]。本研究通過對接種的寄主根毛進行熒光桃紅染色觀察，由于抗病品種帶有抗源，后期根毛浸染率不再增加且較小，而且2 個抗病品種皮層未被侵染，只有‘y972’的皮層被侵染，而且高峰也在6～10 d 之間。因此選擇在接種6 d 觀察根毛侵染率，如果根毛侵染率低于15%，即可初步判斷該品種對根腫病有抗性，如果根毛侵染率高于50%，即可初步判斷該品種為感病品種。

目前對根腫病最有效的防治方法就是選育優良的抗性品種，因此有必要加快育種的步伐，盡快培育出高抗的優良品種，解決十字花科蔬菜的根腫病問題。通過觀察根毛侵染這種方法鑒定抗根腫病品種不僅簡單快捷而且準確高效，為抗根腫病品種的選育奠定了基礎。