非洲豬瘟病毒p30基因的原核表達及間接ELISA抗體檢測方法的建立

吳繼陽

摘要：目的，分析間接ELISA抗體檢測方法的建立以及非洲豬瘟病毒p了0基因的原核表達方式。方法，選擇120例AFR質(zhì)粒，按照隨機分組方式，將其分為觀察組與對照組，每組60個。對照組使用SDS一PAGE檢測方法，觀察組使用間接ELISA抗體檢測方法，對比兩組檢測在非洲豬瘟病毒p30基因原核表達測算以及抗體檢測當(dāng)中的準確性，特異性，靈敏性和重復(fù)性。結(jié)果，觀察組檢測準確性高于對照組，具有顯著差異（P《0.05），觀察組檢測特異性高于對照組，具有顯著差異（P《0.05），觀察組檢測靈敏性高于對照組，具有顯著差異（P《0.05），觀察組檢測重復(fù)性高于對照組，具有顯著差異（P《0.05）。結(jié)論，使用間接ELISA抗體檢測方法在非洲豬瘟病毒p30基因原核表達測算以及抗體檢測當(dāng)中具有良好效果，檢測靈敏度，重復(fù)性均較高，可起到準確的檢測效果。最終測算得出的靈敏度可達到1：1600，在短時間內(nèi)的重復(fù)性和批量重復(fù)性異系數(shù)均小于10%。

關(guān)鍵詞：非洲豬瘟病毒;p30基因原核表達;抗體檢測方法

非洲豬瘟病毒主要可以引起非洲豬瘟疾病，表征主要以高熱、淋巴結(jié)及臟器嚴重出血作為特征，具有較高的接觸傳染性，死亡率達到95%～100%。這種疾病不僅會嚴重影響?zhàn)B殖行業(yè)，還會影響經(jīng)濟發(fā)展，我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部將其列為一類動物疫病進行重點防治。檢測血清中非洲豬瘟病毒抗體間接ELISA抗體檢測方法可以對豬瘟p30基因原核表達方式進行有效的測算，同時相對于采用SDS-PAGE檢測方法對重組蛋白進行鑒定。可以更加有效地提高檢測的特異性，敏感性和重復(fù)性。從目前分析研究結(jié)果可以看出，使用間接ELISA抗體純化重組蛋白作為語言抗檢測進行基因測算，可以更加有效地對基因進行克隆，在原核表達載體測算當(dāng)中可以獲得顯著效果。同時，這種檢測還可以對Winston?boarding病毒測算系列的純化結(jié)果具有良好的優(yōu)化濃度效果。本文主要結(jié)合病毒抗體SDS-PAGE檢測方法以及間接ELISA抗體檢測方法對重組蛋白進行表達界定。

1材料與方法

1.1一般材料

在實驗范圍內(nèi)選擇120例非洲豬瘟p30基因的質(zhì)粒。采用試劑盒檢測方式，由南京金斯瑞生物科技有限公司進行p30基因合成，探討astarDNA聚合酶的含量，并通過連接酶質(zhì)粒DNA小量純化試劑盒進行有效檢驗。

1.2方法

對照組參照genbank已經(jīng)公布的SDS-PAGE檢測方式進行核苷酸序列測驗，對上游引物ggtill以及下游引物酶切位點進行保護堿基測算。引用工程最終由上海嘉寶娜公司合成，并測定p30基因完整的開放閱讀框，除此之外，對基因進行克隆以及質(zhì)粒的構(gòu)建，選擇PCR模板進行擴建PCR反應(yīng)的條件，在98C的范圍內(nèi)進行預(yù)變性測算，測算時間為2分鐘。在98C范圍內(nèi)進行變.性基因測算測算時間為十秒鐘，在56C范圍內(nèi)進行退火測算，實驗時間為15秒鐘，在72C范圍內(nèi)進行延伸變性實驗，時間為45秒鐘，共32個基因循環(huán)序列組。測算之后，采用試劑盒回收方法，對于雙酶切p30基因片段核原核表達載體進行回收，并在16C范圍內(nèi)進行連續(xù)24小時的重組質(zhì)粒檢測。檢測之后對Trace感受細胞進行細菌液檢測，重組載體獲得為pet-30。

觀察組使用間接ELISA抗體檢測方法建立間接抗體檢測，首先對抗體最佳濃度和血清最佳稀釋倍數(shù)進行確定，采用方正檢測方式分別將重組蛋白稀釋到37.1、18.6、9.34倍進行孔檢測。其次在1：110：200濃度下，分別對測算事業(yè)進行稀釋，稀釋之后在37C范圍內(nèi)進行孵化，時長為1小時，在38C范圍內(nèi)進行孵化，時長為10分鐘。對顯示效果進行鑒定，挑選接近l.0的陽性值，再經(jīng)過二次封閉液選擇之后對酶標記濃度進行二次檢測，通過臨界值分析在上述優(yōu)化時間范圍之內(nèi)進行基因序列檢測，從而確定豬繁殖與呼吸倍數(shù)，從而判定陽性特性值。

1.3觀察指標

觀察兩組檢測重復(fù)性，靈敏度，特異性。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法

統(tǒng)計學(xué)軟件為SpSS21.0。計量資料采用t檢驗，以均數(shù)土標準差（x士s）表示;計數(shù)資料以X2檢驗，以率（%）表示。P《0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

觀察組重復(fù)性情況顯著好于對照組，兩組之間具有顯著差異（P《0.05）

觀察組特異性顯著好于對照組，兩組之間具有顯著差異（P《0.05）。觀察組敏感性情況顯著好于對照組，兩組之間具有顯著差異（P《0.05）。

3結(jié)論

使用間接ELISA抗體檢測方法在非洲豬瘟病毒p30基因原核表達測算以及抗體檢測當(dāng)中具有良好效果，檢測靈敏度，重復(fù)性均較高，可起到誰確的檢測效果。最終測算得出的靈敏度可達到1：1600，在短時間內(nèi)的重復(fù)性和批量重復(fù)性異系數(shù)均小小10%。