超高效液相色譜-串聯質譜法快速測定紅棗中甜菜堿

張金磊 邢麗杰 王遠 羅瑞峰

摘要?[目的]建立紅棗中甜菜堿的超高效液相色譜-串聯質譜（UPLC-MS/MS）快速分析測定方法。[方法]樣品經甲醇超聲提取，正相硅膠色譜柱（HILIC，50 mm×2.1 mm，1.7 μm）分離，乙腈-水等度洗脫，采用多反應監測（multiple reaction monitoring，MRM）正離子模式對紅棗中甜菜堿進行測定。[結果]在優化條件下，甜菜堿在1～200 ng/mL均呈現良好的線性關系（R2=0.998 8），檢出限為0.025 mg/kg，定量限為0.050 mg/kg。在紅棗樣品中進行3個水平的添加試驗（n=6），平均回收率為83.6%～94.2%，相對標準偏差1.6%～2.7%。對紅棗樣品中甜菜堿進行了測定，含量在0.39～3.04 g/kg。[結論]該方法適用于紅棗樣品中甜菜堿的測定。

關鍵詞?甜菜堿;超高效液相色譜-串聯質譜法（UPLC-MS/MS）;紅棗

中圖分類號?TS?207.3文獻標識碼?A文章編號?0517-6611（2020）17-0213-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.17.055

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Rapid Determination of Betaine in Red Date by UPLC?MS/MS

ZHANG Jin?lei， XING Li?jie， WANG Yuan et al

（ Analysis and Testing Center， Xinjiang Academy of Agriculture and Reclamation Science， Shihezi， Xinjiang 832000）

Abstract?[Objective] To establish an ultra?high performance liquid chromatography?tandem mass spectrometry （UPLC?MS/MS） rapid analysis method for betaine in red dates.[Mothod]Samples were extracted by ultrasound with acetonitrile，and then the analyses were separated on an silica gel column （50 mm×2.1 mm， 1.7 μm） by gradient elution using a mixture of water and acetonitrile as mobile phase. The determination of betaine in red date was performed by electrospray ionization in the positive ion mode under multiple reaction monitoring （MRM） mode. [Result]Under optimized conditions， betaine showed a good linear relationship between 1 and 200 ng/mL （R2 = 0.998 8）. The detection limits and quantification limits were 0.025 mg/kg and 0.050 mg/kg.The average recovery rate was 83.6%-94.2% at the three spiked levels in blank red date samples （n=6）， and the relative standard deviation was 1.6%-2.7%. The method was applied to the determination of red date samples， and the content was 0.39-3.04 g/kg. [Conclusion]The method is suitable for determination of betaine in red date.

Key words?Betaine;Ultra performance liquid chromatography?tandem mass spectrometry （UPLC?MS/MS）;Red date

紅棗是我國700多個品種中干食最為優良的品種之一，主要種植在山東、山西、陜西、河南、河北、甘肅和新疆等地。由于地理位置和自然環境的不同，紅棗中的化學成分差異很大[1]。紅棗具有豐富的營養成分，包括糖類、脂肪酸、氨基酸、礦物質、維生素、多酚等抗氧化物質[2]。據報道，紅棗中的活性物質具有抗炎、抗氧化、護肝、抑制乳腺癌細胞和調節免疫活性的能力[3-6]。

甜菜堿是一種水溶性的季銨鹽化合物[7-8]，是紅棗中主要的生物堿之一，具有調節體內滲透壓、促進脂肪代謝、提供甲基供體的功能。同時，在防止肝損傷和抑制癌癥的發展中具有重要的生物學意義[9-10]。目前測定甜菜堿含量的方法主要包括比色法[11]、滴定法[12]、薄層色譜法[13]、離子色譜法[14-15]、高效液相色譜法[16-17]、液相色譜-串聯質譜法[18-20]等。其中，比色法前處理較為繁瑣，結果的準確度和重復性較低;滴定法雖然成本低，但受樣品中色素等雜質的干擾，測定終點不易判斷;高效液相色譜法測定甜菜堿，由于甜菜堿結構中無共軛體系，幾乎沒有紫外吸收，需要在低波長下才能檢測，靈敏度相對較低。液相色譜-串聯質譜法是近年來比較主流的分析工具，以其分析速度快、準確性和靈敏度高等特點被廣泛應用于農產品和食品檢測。

該研究建立了快速測定紅棗中甜菜堿的超高效液相色譜-串聯質譜方法，優化了提取溶劑、超聲時間和提取體積等因素對提取效率的影響，并將該方法應用于實際紅棗樣品的測定。

1?材料與方法

1.1?試劑與材料

甲醇、乙腈、乙酸銨、甲酸（HPLC級），德國CNW公司;甜菜堿（純度>98.9%），德國Dr.Ehrenstorfer公司;超純水;紅棗（購置于新疆地區不同超市、農貿市場和生產基地）去核，經勻漿機（10 000 r/min）勻漿后裝入樣品袋中置于-20 ℃下冷凍保存備用。

1.2?儀器設備

超高效液相色譜-串聯質譜儀（Waters Xevo TQ），美國Waters公司;漩渦混合器（MS3 basic），德國IKA公司;高速冷凍離心機（Sigma 3-30k），德國Sigma公司;超聲波清洗器（KQ-600DE型），昆山市超聲儀器有限公司;超純水儀（ULPHW-IV），四川優普超純科技有限公司。

1.3?UPLC-MS/MS檢測條件

色譜柱：BEH HILIC柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）;柱溫30 ℃;流動相組成：水-乙腈（體積比25∶75）;進樣量5 μL;流速0.4 mL/min，等度洗脫。

離子化模式：電噴霧離子源（ESI），正離子模式;質譜掃描方式：多反應監測（MRM）;毛細管電壓3.2 kV，離子源溫度150 ℃，脫溶劑溫度400 ℃，脫溶劑氣流量800 L/h。甜菜堿在MRM模式下的母離子為118，子離子為58*/59（*為定量離子），錐孔電壓34 V，碰撞能量21*/17 eV。

1.4?樣品前處理

稱取經勻漿后的紅棗1.00 g（精確至001 g）于50 mL離心管中，加入25 mL甲醇，渦旋振蕩1 min，30 ℃下恒溫超聲提取30 min;在10 000 r/min下離心5 min，轉移至另一支50 mL離心管中;在殘渣中繼續加入10 mL甲醇，30 ℃下恒溫超聲提取30 min;在10 000 r/min下離心5 min，合并上清液，取上清液過0.22 μm有機濾膜，經UPLC-MS/MS分析。待測物含量過高的樣液，用甲醇適當稀釋至線性范圍內再進行測定。

1.5?標準溶液的配制

準確稱取甜菜堿標準品10 mg，用甲醇溶于10 mL容量瓶中，配制成質量濃度為1.0 mg/mL的標準儲備液，置于-20 ℃避光保存。用甲醇將標準儲備液逐級稀釋，配制成1、2、5、10、20、50、100和200 ng/mL的甜菜堿系列工作溶液，置于4 ℃避光保存。

2?結果與分析

2.1?質譜和色譜條件的優化

2.1.1?質譜條件的優化。

在電噴霧電離和多反應監測模式下，對500 ng/mL甜菜堿標準溶液流動注射泵連續進樣，通過對脫溶劑溫度、毛細管電壓、錐孔電壓、碰撞能量等質譜參數進行優化。選擇穩定性好、豐度高和干擾小的2個碎片離子作為甜菜堿定性離子和定量離子，并以豐度最強、響應值最高的離子對作為定量離子對。圖1為濃度為500 ng/mL標準溶液中甜菜堿的MRM離子對質譜圖。

2.1.2?色譜條件的優化。

通過比較水-乙腈、水-甲醇、水（含0.1%甲酸）-乙腈、0.1%甲酸水溶液-甲醇和5 mmol/L乙酸銨溶液（含0.1%甲酸）-乙腈5種流動相體系對甜菜堿響應的影響，結果發現（圖2），當流動相為水-乙腈體系和5 mmol/L乙酸銨溶液（含0.1%甲酸）-乙腈時，甜菜堿的響應較高;而當流動相為5 mmol/L乙酸銨溶液（含0.1%甲酸）-乙腈時，甜菜堿色譜峰具有更好的對稱性。因此該試驗最終選擇5 mmol/L乙酸銨溶液（含0.1%甲酸）-乙腈作為檢測紅棗中甜菜堿的流動相體系。

2.2?前處理條件的優化

2.2.1?提取溶劑的優化。

該試驗分別采用純水、20%甲醇水溶液、40%甲醇水溶液、60%甲醇水溶液、80%甲醇水溶液和純甲醇6種不同溶劑提取紅棗中的甜菜堿。從圖3可看出，隨著甲醇含量的增加，甜菜堿的提取效率也不斷增加，提取回收率在75%～95%。當采用純甲醇提取，回收率達到最大值（95%），高于其他提取溶劑，因此該試驗選取純甲醇作為最佳提取溶劑。

2.2.2?提取溶劑體積的優化。

采用甲醇提取紅棗中的甜菜堿，在樣品量和其他條件一致的情況下，考察了不同體積（10、15、20、25、30 mL，分2次提取）甲醇對甜菜堿提取效率的影響。結果發現（圖4），隨著甲醇體積的增大，回收率先升高后下降。當甲醇提取溶液體積為25 mL時，提取效率最高。

2.2.3?超聲時間對提取效率的影響。

在優化的提取溶劑和體積條件下，該研究考察了不同超聲時間（10、20、30、40、50、60 min）對甜菜堿提取效率的影響。結果表明（圖5），隨著超聲時間的增加，提取效率先增大后減小。當超聲提取時間為30 min時，甜菜堿的提取效率最高。故該試驗選擇超聲30 min為最優提取時間。

2.3?方法學考察

2.3.1?線性關系和檢出限。

通過向紅棗基質中添加與本身

含量相當量的甜菜堿標準品，比較添加前后的峰面積，評價其基質效應大小。根據試驗結果顯示，紅棗中甜菜堿檢測的基質效應不顯著。在優化的前處理和儀器條件下，對一系列甜菜堿標準工作溶液進行了測定，以定量離子峰面積為縱坐標、濃度為橫坐標進行回歸分析，得出線性方程為y=1 053.81x+104397（R2=0.998 8），表明甜菜堿在1～200 ng/mL呈現良好的線性關系。在信噪比S/N為3時，計算甜菜堿的檢出限為0.025 mg/kg，在信噪比S/N為10時，計算甜菜堿的定量限為0.05 mg/kg。該方法線性關系良好、靈敏度高。