廣西水稻地方品種核心種質礦質元素含量差異及相關分析

夏秀忠 張宗瓊 農保選 楊行海 曾宇 荘潔 劉開強 李丹婷

摘? 要： 以419份廣西水稻地方品種核心種質的糙米為材料，分別于2014和2015年測定了Ca、Fe、Zn和Se 4種礦質元素含量，同時利用34個SSR標記對兩年礦質元素含量進行Pearson相關分析。結果表明：4種礦質元素在兩年間的鑒定結果存在極顯著差異，呈顯著正相關。秈稻的Ca、Se平均含量高于粳稻，Ca（2014）、Se（2014）在秈粳稻間呈顯著性差異;粳稻的Fe、Zn平均含量高于秈稻，Fe（2015）、Zn（2014，2015）在秈粳間呈顯著性差異。礦質元素含量與稻作區經緯度、海拔等因素相關，Fe平均含量在桂南稻作區最高，Zn平均含量在桂中稻作區最高;Ca、Fe、Zn平均含量在黑米中含量最高，Se在紅米中含量最高;Ca和Zn平均含量在黑米與紅米、黑米與白米之間存在顯著差異，Fe無顯著差異。4種礦質元素含量在2年間的相關系數范圍為0.159～0.557，均呈極顯著正相關。2014年4種元素含量間無顯著性相關;2015年Se和Fe、Zn之間呈顯著正相關（P<0.05），Zn和Fe之間顯著正相關（P<0.01），Zn和Ca之間極顯著正相關（P<0.001）。SSR標記共檢測到167個等位基因，平均4.91個，遺傳多樣性指數為0.574，遺傳信息量為0.522。經Pearson相關分析，4種礦質元素共關聯到18個相關位點，其中8個位點與前人的研究結果不相同。

關鍵詞： 廣西水稻;地方品種;核心種質;礦質元素;相關分析

中圖分類號： S511? ? ? 文獻標識碼： A

Abstract： The content of Ca， Fe， Zn and Se in brown rice of 419 core collection accessions of Guangxi landrace was analyzed in 2014 and 2015. A total of 34 SSR markers were used to identify the content of four mineral elements by Pearson correlation analysis in the two years. The content of the four mineral elements in the two years was significantly different and positively correlated. The content of Ca and Se in indica was higher than that in japonica with significant difference. The content of Fe and Zn in japonica was higher than that in indica with significant difference. The content of mineral elements was associated with longitude， latitude and altitude of the rice cropping regions. The content of Fe was the highest in southern Guangxi， that of Zn was the highest in central Guangxi， that of Ca， Fe， Zn was the highest in black rice， that of Se was the highest in red rice， that of Ca and Zn of black rice was significantly higher than that of red and white rice， and that of Fe was not significantly among three pericarp colors. The range of correlation coefficient of the content of the four mineral elements between the two years from 0.159 to 0.557， 2014 was significantly positively associated with 2015. There was no obvious difference among the content of the four elements in 2014. In 2015， the content of Se was significantly positively correlated with that of Fe and Zn （P<0.05）， the content of Zn was significantly positively associated with that of Fe （P<0.01） and Ca （P<0.001）. A total of 167 alleles were detected by SSR markers， with genetic diversity index 0.574 and genetic information 0.522. Pearson correlation analysis showed that 18 loci were associated to the content of the four mineral elements， among them， eight loci weree different from the previous studies. The study would provide a theoretical basis and material foundation for related gene mining and rice breeding with high mineral element content.

Keywords： Guangxi rice; landraces; core collection; mineral content; correlation analysis

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.08.014

水稻是我國主要糧食作物之一，稻米富含大量人體所必需的礦質元素[1]。我國居民食物中70%的熱量和 65% 的蛋白質及大部分礦質元素來自稻米[2]。隨著人們飲食和生活習慣的改變，營養失衡日漸明顯，微量礦質營養元素攝入過低，影響人們的健康。從水稻中攝入礦質元素，成為改善人們營養的有效途徑之一。可通過培育高礦質元素含量的水稻品種，滿足人體營養和健康需求。

篩選出高礦質元素含量的水稻種質資源是開展相關研究的前提和基礎。許多學者通過對稻種資源的研究認為，由于地理差異、遺傳進化和人工選擇的原因，水稻的礦質元素含量因品種類型不同，產生較大的遺傳差異。水稻籽粒礦質元素含量變異與農藝性狀、品質性狀、品種類型以及品種來源地之間，存在顯著的相關性[3-5]。Huang等[6]經2 a的對比實驗研究認為Ca、Na和K主要受基因型的影響，而Fe、Zn和Cu主要受環境的影響，并鑒定出多個與礦質元素含量相關的SNP位點。柏鶴等[7]研究認為水稻單一特殊性狀或2～3個特殊性狀的聚合對Fe、Ca和Zn含量的提高方面具有增加效應。張名位等[8]研究認為水稻礦質元素含量受不同地區、不同年份的影響，產生較大的遺傳變異，體現了不同基因型與環境互作的差異。

近年來，隨著分子生物技術的快速發展，在水稻中鑒定出多個與礦質元素相關基因及位點[4， 9-13]。而廣西可能為栽培稻的起源中心[14]，擁有豐富的稻種資源，遺傳多樣性高，為篩選出高礦質元素含量的稻種資源、培育高礦質元素含量的特種資源提供良好的前提條件。本研究將通過對廣西栽培稻核心種質的Ca、Fe、Zn和Se 4種礦質元素含量進行測定，分析礦質元素含量在不同種植年份、種皮色、不同稻作區之間的差異，利用SSR分子標記和礦質元素含量之間進行相關分析，獲得顯著關聯的分子標記，為選育高礦質元素含量水稻品種的親本選擇、挖掘與礦質元素含量相關基因提供材料基礎和理論依據。

1? 材料與方法

1.1? 材料

試驗材料來源于廣西水稻地方品種初級核心種質419份如表1。

1.2? 方法

1.2.1? 礦質元素含量測定方法? 所有試驗材料于2014、2015年晚造種植于廣西農業科學院水稻研究所實驗田，屬雙季稻區。稻田土壤主要營養成分為交換性Ca： 6.4 cmol/kg;有效Fe： 137.9 mg/kg;有效Zn： 1.47 mg/kg;全Se： 0.39 mg/kg。收獲后種子經自然干燥，礱谷機脫殼成糙米，再經粉碎機研磨成粉。礦質元素含量測定以糙米為材料進行測定，由廣西農業科學院農產品質量安全與檢測技術研究所進行Ca、Fe、Zn和Se元素含量測定。Ca、Fe、Zn按照LY/T 1270?1999的規定方法檢測，全Se按照GB 5009.93?2010規定的方法檢測。

1.2.2? SSR標記相關分析? 利用均勻分布水稻染色體的34對SSR引物進行PCR分析，每條染色體上取2～4對。采用CTAB法提取水稻葉片DNA，用1%瓊脂糖凝膠和BioSpec nano檢測質量和濃度，工作液濃度稀釋至20 ng/μL，20 ℃保存備用。PCR反應程序為： 95 ℃預變性4 min;95 ℃變性35 s，55 ℃退火35 s，72 ℃延伸45 s，32個循環，最后72 ℃延伸5 min，5 ℃保存。擴增產物用6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，0.1% AgNO3染色及顯影。采用Pearson相關分析法確定與礦質元素含量相關基因連鎖的分子標記。當2 a的P<0.05時，認為該標記與基因連鎖。

1.3? 數據處理

采用SPSS Statistics 24軟件進行描述統計、t檢驗、Pearson相關分析和方差分析;Origin 8.0軟件進行圖形繪制;Powermarker V3.25軟件分析等位基因數量、遺傳多樣性指數和遺傳信息量。

2? 結果與分析

2.1? 核心種質礦質元素含量分析

419份核心種質糙米2014、2015年的Ca、Fe、Zn和Se 4種礦質元素平均含量、標準差（SD）、變異幅度和變異系數（CV）如表2。對供試材料進行兩年間的差異顯著性檢測，結果表明，4種元素2014、2015年之間分析結果均呈現極顯著差異。

2014年Ca、Fe、Zn和Se含量分別為183.62、16.61、24.77和0.0178 mg/kg;2015年含量分別為160.04、17.76、25.32和0.0196 mg/kg，Ca（2015）比Ca（2014）平均含量降低，而Fe、Zn和Se平均含量升高。2014年CV和Max/Min大小依次為： Se>Ca>Fe>Zn;2015年CV和Max/Min大小依次為： Se>Fe>Zn>Ca，Se（2014、2015）的CV值和Max/Min值最大，CV值分別為60.08%和46.42%，Max/Min值分別為66和54，說明水稻Se在4種礦質元素中的基因型差異最大，遺傳多樣性最為豐富。

本研究從供試材料中篩選出礦質元素含量較高的種質，如C85、C136、C52、C278和C172鈣含量較高;C353、C321、C333、C332和C313鐵含量較高;C2、C192、C195、C310和C383等種質Se含量較高;C29、C206、C355、C362和C360鋅含量較高;2 a的檢測結果含量穩定，礦質元素含量受環境影響較小。

2.2? 水稻的礦質元素含量在類型間的差異分析

419份核心種質材料中有330份秈稻和89份粳稻，兩年的統計結果表明，Ca和Se的平均含量秈稻高于粳稻，Ca（2014）、Se（2014）在秈粳稻之間呈顯著性差異;Fe和Zn的平均含量粳稻高于秈稻，Fe（2015）、Zn（2014，2015）在秈粳稻之間呈顯著性差異（圖1）。

2.3? 礦質元素含量的地域性差異分析

廣西水稻地方品種核心種質來源于4個稻作區，糙米礦質元素含量的地域性差異如圖2。Ca（2014）含量最高為桂南稻作區188.12 mg/kg，Ca（2015）含量最高為高寒山區166.68 mg/kg，Ca含量最低均為桂中稻作區，分別為175.78、156.95 mg/kg;Fe、Zn和Se的平均含量2015年

比2014年均表現升高。Fe含量在2014、2015年最高均為桂南稻作區，分別為16.78、18.12 mg/kg;Zn含量在2014、2015年最高為桂中稻作區，分別為25.77、26.31 mg/kg;最低為桂南稻作區，分別為24.34、24.97 mg/kg;Se（2014）含量最高為桂南稻作區的0.0197 mg/kg，Se（2015）含量最高為桂中稻作區的0.0201 mg/kg;最低均為桂北稻作區，分別為0.0136、0.0176 mg/kg。

方差分析結果表明：Ca（2014）桂南稻作區與高寒稻作區呈顯著性差異，Ca（2015）中高寒稻作區與桂中稻作區呈顯著性差異;Fe（2014、2015）在4個稻作區之間無顯著性差異;Zn（2014、2015）在桂中稻作區與桂南稻作區呈顯著性差異;Se（2014）在桂南稻作區與其它3個稻作區呈顯著性差異，Se（2015）在4個稻作區之間無顯著性差異。

2.4? 礦質元素含量在種皮色間差異及相關分析

礦質元素含量以糙米種皮色進行分組，3種皮色的礦質元素平均含量之間存在較大的差異。在2014、2015年，Ca、Fe、Zn在黑米中含量最高。Ca含量分別為210.43、187.62 mg/kg，Fe含量分別為17.33、18.35 mg/kg，Zn含量分別為27.43、28.47 mg/kg。方差分析結果表明，Ca和Zn（2014、2015）含量在黑米與紅米、黑米與白米之間呈顯著性差異，紅米與白米之間差異不顯著;而Fe（2014、2015）含量在黑米、紅米、白米之間均無顯著性差異。Se在紅米中含量最高，2014年和2015年分別為0.0202、0.0216 mg/kg，顯著高于黑米和白米（2015年，紅米與黑米間差異不顯著除外）;2014年Se含量白米高于黑米，2015年Se含量白米低于黑米，但差異均不顯著（圖3）。

2.5? 4種礦質元素之間的相關分析

419份核心種質材料礦質元素配對相關分析結果如表3。Ca、Fe、Zn、Se在兩年間的相關系數范圍為0.159～0.557，均呈極顯著正相關（P< 0.001）。2014年4種元素含量間無顯著性相關;2015年Se和Fe、Zn之間呈顯著正相關（P<0.05），其中Se和Fe的正相關性與孫明茂等[15]的研究結果相反，可能與使用材料的群體類型有關;Zn和Fe之間顯著正相關（P<0.01），Zn和Ca之間極顯著正相關（P<0.001）。

2.6? 4種礦質元素與SSR分子標記間的Pearson相關分析

用34對SSR標記對419份核心種質進行分子檢測，共擴增167個有效等位基因，每個標記數量范圍2～9個，平均4.91個，遺傳多樣性指數為0.574，遺傳信息量為0.522。以2014、2015兩年的鑒定結果進行比較，經Pearson相關分析，選擇2 a均達P<0.05顯著相關為連鎖相關區域。結果如表4。

Ca在第5、10染色體有顯著關聯位點，其中RM274標記顯著關聯，與劉杰[16]定位的qCa5位點一致;RM8201尚未發現定位QTL位點。

Fe與第7染色體RM134標記顯著相關，其附近區域OsNAS3（煙酰胺全成酶）基因已經被克隆，激活煙草胺合成酶OsNAS3能增加水稻幼苗根部和地上部以及谷粒中的礦物質含量，增強對Fe和Zn缺乏的耐受力[17]。

Zn在第3、5、6、7、8、9、10、11、12染色體上均有關聯位點。其中位于第3染色體RM16與沈希宏等[2]定位的QTL-qZNCN-3區域接近;第5染色體RM169與Garcia-Oliveira等[18]定位QTL-qZN5-1接近;第6染色體的RM314和RM30尚未發現定位QTL位點;第7染色體RM234與Anuradha等[19]定位qZN7.1區域接近;第8染色體上RM408標記與Garcia-Oliveira等[18]定位QTL-qZN8區域一致;第9染色體RM434與黃瑩瑩等[13]定位的QTL-qZN-9區域接近，RM201與Du等[20]定位的QTL-qZN-9區域一致;第10染色體RM216和RM8201呈極顯著負相關，尚未發現相關QTL位點;第11染色體RM206與Norton等[21]定位的QTL-qZN*11區域接近;第12染色體上RM19與Swamy等[22]定位的QTL-qZN12.1區域接近。

相關分析結果表明，Ca（RM8201）;Zn（RM314、RM30、RM284、RM205、RM216、RM8201）;Se（RM9）8 個關聯位點與其他研究學者研究結果不一致。

3? 討論

前人研究結果表明，水稻籽粒礦質元素含量受基因型[24]、環境[5]等因素的影響。本研究通過分析419份廣西水稻地方品種核心種質材料兩年的礦質元素含量表明，Ca、Se含量秈稻高于粳稻、Fe、Zn含量粳稻高于秈稻。4種礦質元素受不同年份的環境因素影響較大，均表現為極顯著差異，這與Huang等[6]的研究結果一致。Ca在2015年的鑒定結果中出現不同程度的下降，而Fe、Se、Zn的積累反而升高。

水稻礦質元素含量存在緯度的差異[1，5] ，廣西依據緯度和海拔進行稻作區劃分，且桂南稻作區的隆安縣可能為栽培稻的起源中心[14]。本研究結果表明，高Ca含量種質材料主要分布于桂南稻作區和高寒山區，高Fe含量種質材料主要分布于桂南稻作區;高Zn含量種質材料主要分布于桂中稻作區;高Se含量種質材料來源于桂南和桂中稻作區。與曾亞文等[25]的研究結果提出生物多樣性中心的糙米礦質元素Ca和Fe的含量最高的研究結果一致。廣西地方稻種資源核心種質Ca、Fe、Zn含量平均值低于云南稻核心種質[3]和其它不同地區稻種資源的礦質元素含量[26-28]。但廣西的栽培稻地方品種資源中存在礦質元素含量較高的特異性種質，2 a檢測結果重復性好，糙米中含量高且穩定，受環境的影響小。如C210和C362富含Ca、Fe、Zn 3種礦質元素;C29和C206富含Zn、Se兩種礦質元素;C250富含Fe、Se兩種礦質元素等，可作為選育高富礦質元素水稻品種和基因定位群體構建的親本材料。

相關研究結果表明，礦質元素含量與水稻種皮色之間存在顯著的相關性[29-31]，本研究結果也證實了這一觀點。黑米中的Ca、Fe、Zn含量最高，紅米中Se含量最高，其中Ca（2015）和Se（2015）與種皮色呈顯著正相關關系。

前人鑒定出多個與礦質元素相關QTLs，部分位點已被克隆[2，13，16，18-23，32]。本研究發現多個與礦質元素相關聯的位點，部分位點與前人定位的QTL位點區域一致或者相似，有8個關聯位點未發現相似位點，可進一步研究驗證，挖掘相關基因。培育高礦質元素含量水稻品種的目標是要獲得高礦質元素含量、穩定性強、適應性廣的品種。本研究通過對種質資源鑒定和篩選，獲得高礦質元素含量的創新種質，以這些特殊材料作為育種親本，通過系譜選擇等方法，進行聚合育種[30]，獲得2個或以上特殊性狀的聚合種質材料，創制高富營養保健功能的特種稻種質。

參考文獻

江? 川， 王金英， 鄭金貴.稻米礦質營養元素含量受種植環境的影響研究[J]. 福建農業學報， 2004， 19（1）： 1-6.

沈希宏， 曹立勇， 邵國勝， 等.水稻籽粒中5種微量元素含量的QTL定位[J]. 分子植物育種， 2008， 6（6）： 1061- 1067.

曾亞文， 劉家富， 汪祿祥， 等.云南稻核心種質礦質元素含量及其變種類型[J].中國水稻科學， 2003， 17（1）： 25-30.

Gregorio B G， Senadhira D， Htut H， et al. Breeding for trace mineral density in rice[J]. Food and Nutrition Bulletin， 2000， 21（4）： 382-386.

Pinson S R M， Tarpley L， Yan W G. Worldwide genetic diversity for mineral element concentrations in rice grain[J]. Crop Science， 2015， 55（1）： 294-311.

Huang Y， Tong C， Xu F F， et al. Variation in mineral elements in grains of 20 brown rice accessions in two environments[J]. Food Chemistry， 2016， 192（1）： 873-878.

柏? 鶴， 馬小定， 曹桂蘭， 等. 不同類型特種稻種質營養及功能性成分含量的差異[J]. 植物遺傳資源學報， 2017， 18（6）： 1013-1022.

張名位， 杜應瓊， 彭仲明， 等. 黑米中礦質元素鐵、鋅、錳、磷含量的遺傳效應研究[J]. 遺傳學報， 2000， 27（9）： 792- 799.

胡標林， 黃得潤， 肖葉青， 等.應用東鄉野生稻回交重組自交系群體分析糙米礦質含量QTL[J].中國水稻科學， 2018， 32（1）： 43-50.

邵源梅， 李少明， 楊天麗， 等.水稻不同基因型礦質元素含量差異及分布研究[J].西南農業學報， 2016， 29（5）： 1006-1011.

張現偉， 楊? 莉， 張? 濤， 等. 水稻子粒硒含量的遺傳及QTL檢測[J]. 植物遺傳資源學報， 2010， 11（4）： 445-450.

Gregorio G B. Progress in breeding for trace minerals in staple crops[J]. Journal of Nutrition， 2002， 132（3）： 500-502.

黃瑩瑩， 鄒德堂， 王敬國， 等. 水稻子粒錳、鐵、鋅、銅含量的QTL定位分析[J]. 作物雜志， 2012（6）： 77-81.

Huang X H， Kurata N， Wei X H， et al. A map of rice genome variation reveals the origin of cultivated rice[J]. Nature， 2012， 490（7421）： 497-501.

孫明茂， 楊昌仁， 李點浩， 等. 粳稻“龍錦1號/香軟米1578”F3家系群糙米礦質元素含量變異及相關性分析[J]. 中國水稻科學， 2008， 22（3）： 290-296.

劉? 杰. 稻米中8種礦質元素含量的QTL定位[D]. 北京： 中國農業科學院， 2010.

Lee S， Jeon U S， Lee S J， et al. Iron fortification of rice seeds through activation of the nicotianamine synthase gene[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2009， 106（51）： 22 014-22 201.

Garcia-Oliveira A L， Tan L B， Fu Y C， et al. Genetic identification of quantitative trait Loci for contents of mineral nutrients in rice grain[J]. Journal of Integrative Plant Biology， 2009， 51（1）： 84-92.

Anuradha K， Agarwal S， Rao Y V， et al. Mapping QTLs and candidate genes for Iron and Zinc concentrations in unpolished rice of Madhukar×Swarna RILs[J]. Gene， 2012， 508（2）： 233-240.

Du J， Zeng D， Wang B， et al. Environmental effects on mineral accumulation in rice grains and identification of ecological specific QTLs[J]. Environmental Geochemistry and Health， 2013， 35（2）： 161-170.

Norton G J， Duan G L， Lei M， et al. Identification of quantitative trait loci for rice grain element composition on an Arsenic impacted soil： Influence of flowering time on genetic loci[J]. Annals of Applied Biology， 2012， 161（1）： 46–56.

Swamy B P M， Kaladhar K， Anuradha K， et al. QTL analysis for grain iron and zinc concentrations in two O. nivara derived backcross populations[J]. Rice Science， 2018， 25（4）： 197-207.

Inoue H， Higuchi K， Takahashi M， et al. Three rice nicotianamine synthase genes， OsNAS1 OsNAS2， and OsNAS3 are expressed in cells involved in long-distance transport of iron and differentially regulated by iron[J]. Plant Journal， 2003， 36（3）： 366-381.

Zeng Y W， Zhang H L， Wang L X， et al. Genotypic variation in element concentrations in brown rice from Yunnan landraces in China[J]. Environmental Geochemistry and Health， 2010， 32（3）： 165-177.

曾亞文， 汪祿祥， 普曉英， 等. ICP-AES檢測云南稻核心種質礦質元素含量的地帶性特征[J]. 光譜學與光譜分析， 2009， 29（6）： 1691-1695.

周崇松， 劉文宏， 范必威， 等. 川稻中銅鐵鋅錳四種微量元素的研究[J]. 廣東微量元素科學， 2003（10）： 56-59.

劉憲虎， 孫傳清， 王象坤. 我國不同地區稻種資源的鐵、鋅、鈣、硒四種元素的含量初析[J].北京農業大學學報， 1995， 21（2）： 138-142.

曾亞文， 申時全， 汪祿祥， 等.云南稻種礦質元素含量與形態及品質性狀的關系[J]. 中國水稻科學， 2005， 19（2）： 127-131.

裘凌滄， 潘? 軍， 段彬伍.有色米及白米礦質元素營養特征[J]. 中國水稻科學， 1993， 7（2）： 95-100.

韓龍植， 南鐘浩， 全東興， 等. 特種稻種質創新與營養特性評價[J]. 植物遺傳資源學報， 2003， 4（3）： 207-213.

王麗華.紅米的微量元素測定與糙米色素基因的定位[D]. 雅安： 四川農業大學， 2007.

Anuradha K， Agarwal S， Batchu A K， et al. Evaluating rice germplasm for iron and zinc concentration in brown rice and seed dimensions[J]. Journal of Phytology， 2012， 4（1）： 19-25.