蒲公英根多酚對腦損傷小鼠認(rèn)知和氧化應(yīng)激的作用

張健強(qiáng)

（江西省德興市人民醫(yī)院外一科，德興 334200）

蒲公英作為一種中藥已經(jīng)被廣泛使用， 其根部也被認(rèn)為具有抗菌消炎、消腫止痛等功效[1]。 植物多酚已被證實(shí)具有多種功效，經(jīng)過研究開發(fā)，已有部分多酚物質(zhì)被應(yīng)用在制藥行業(yè)[2]。 大腦是人體中樞神經(jīng)系統(tǒng)的核心，受損后對人體意識、行動、生理活動都有直接影響， 嚴(yán)重的情況下還將危及生命[3]。 同時，機(jī)體的氧化應(yīng)激平衡被打破出現(xiàn)氧化應(yīng)激失衡，將加劇組織損傷[4]。 本研究探究多酚對腦損傷小鼠認(rèn)知的恢復(fù)作用及氧化應(yīng)激失衡的抑制作用， 為蒲公英根多酚的進(jìn)一步應(yīng)用探索新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 蒲公英根，杭州聚修堂健康科技有限公司；SOD、CAT、MDA 試劑盒，南京建成生物工程研究所；BCA 蛋白測定盒，天根生化科技有限公司，SDS-PAGE 聚丙烯酰胺凝膠、PVDF 膜，美國Invitrogen 公司;一抗(SOD1、ab13498,CAT、ab76110,cAMP Protein Kinase Catalytic subunit、ab76238，p-CREB、ab32096)、二 抗 （ab6728）， 美 國 Abcam 公司；其余化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物 8 周齡雄性 SPF 級 C57BL/c 小鼠40 只（體重22-25g），江西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物科技中心。

1.3 儀器與設(shè)備 用顱腦打擊器，深圳市瑞沃德生命科技有限公司；BW-MWM101morris 水迷宮，上海軟隆科技發(fā)展有限公司；LUX 多功能性酶標(biāo)儀，美國賽默飛公司；LAS3000 成像系統(tǒng)，日本富士公司。

1.4 方法

1.4.1 小鼠腦損傷模型 將蒲公英根冷凍干燥后粉碎，然后按文獻(xiàn)方法提取純化得到TRP[5]。 將實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為4 組，分別為正常組、模型組、TRP 低濃度灌胃 （TRPL） 組和 TRP 高濃度灌胃（TRPH）組， 每組10 只小鼠。 正常組外其余各組小鼠用10%的水合氯醛進(jìn)行麻醉（3ml/kg），然后固定小鼠按文獻(xiàn)方法[6]使用用顱腦打擊器打擊小鼠頭部，建立小鼠腦損傷模型。造模24h 后TRPL 和TRPH 組小鼠按濃度100mg/kg 和200mg/kg 分別灌胃TRP，持續(xù)4 周，然后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4.2 空間學(xué)習(xí)、記憶能力和新物體識別能力評估水迷宮實(shí)驗(yàn)采用文獻(xiàn)方法[6]，觀察小鼠在水迷宮平臺所在象限停留時間和穿越平臺次數(shù)評估腦損傷小鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶能力。 在10m×10m 的空曠場地上用文獻(xiàn)方法[6]記錄小鼠探索物體使用的時間，通過公式計算小鼠在對新物體的辨別指數(shù)(%)=探索新物體的時間/探索2 個物體的總時間×100%。

1.4.3 血清指標(biāo)測定 小鼠進(jìn)行眼眶取血后將血漿放入防凝血管中，然后進(jìn)行離心分離（4000 r/min、10 min）， 吸出上層血清用試劑盒測定小鼠血清的SOD、CAT 酶活力和 MD 水平。

1.4.4 Western blot 實(shí)驗(yàn) 斷頸處死小鼠后，取0.5g小鼠腦組織，用PBS 緩沖液洗滌后進(jìn)行勻漿，然后加入裂解液進(jìn)行裂解（4℃、20min），進(jìn)行離心分離（4000r/min、10min）吸出上清液。 然后用 BCA 蛋白測定盒檢測提取出的蛋白總量。取100 μL（蛋白含量 30-50μg）裂解液進(jìn)行上樣，在 SDS-PAGE 聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳。然后在PVDF 膜上進(jìn)行蛋白轉(zhuǎn)膜。 接著加入能夠覆蓋住轉(zhuǎn)膜的封閉液和稀釋后的一抗，在4℃下孵育12h，接著再進(jìn)行洗膜，加入二抗液后在室溫下孵育1h，再次洗膜，最后用化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行蛋白表達(dá)顯色并檢測[12,13]。

1.4.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)處理 所有的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3 次實(shí)驗(yàn)，取平均值，然后用SPSS9.1 統(tǒng)計軟件采用單因素方差分析評價各組數(shù)據(jù)之間是否具有顯著差異（P<0.05）。

2 結(jié)果

2.1 腦損傷小鼠的空間學(xué)習(xí)、記憶能和新物體識別能力 由表1 可以看出，模型組小鼠逃避潛伏時間最長， 穿越平臺次數(shù)和對新舊物體的辨別指數(shù)最少。 TRP 可以顯著減少腦損傷小鼠逃避潛伏時間和增加穿越平臺次數(shù)和對新舊物體的辨別指數(shù)，且濃度越高效果越明顯。

表1 蒲公英根多酚對腦損傷小鼠的空間學(xué)習(xí)、記憶和新物體識別能力的改善效果(±s)

表1 蒲公英根多酚對腦損傷小鼠的空間學(xué)習(xí)、記憶和新物體識別能力的改善效果(±s)

注：a、b、c 分別代表正常組、TRPH 組和 TRPL 組與模型組相比具有顯著差異（P<0.05）

組別 逃避潛伏時間(s) 穿越平臺次數(shù) 對新舊物體的辨別指數(shù)(%)正常組模型組TRPL 組TRPH 組24.88±2.41a 59.35±3.82 48.77±3.18c 37.20±3.06b 6.29±0.55a 1.04±0.29 2.51±0.33c 4.62±0.37b 61.11±2.48a 31.08±3.75 42.87±3.62c 50.83±3.23b

2.2 腦損傷小鼠血清的SOD、CAT 酶活力和MDA水平 由表2 可知模型組小鼠血清的SOD 和CAT酶活力最低，而MDA 水平最高，正常組小鼠呈現(xiàn)相反的趨勢。TRP 能夠顯著（P<0.05）降低腦損傷小鼠血清中的MDA 水平和提升SOD、CAT 酶活力，其中TRPH 組小鼠血清的指標(biāo)更接近正常組。

2.3 腦 損 傷 小 鼠 腦 組 織 的 SOD1、CAT、cAMP Protein Kinase Catalytic subunit 和 p-CREB 蛋白表達(dá) 由圖1 可知,模型組小鼠腦組織中SOD1、CAT、cAMP Protein Kinase Catalytic subunit 和p-CREB蛋白表達(dá)最弱，TRP 可以上調(diào)腦損傷小鼠的SOD1、CAT、cAMP Protein Kinase Catalytic subunit和p-CREB 蛋白表達(dá)， 且上調(diào)的作用與TRP 濃度呈正相關(guān)，濃度越高，表達(dá)越接近正常小鼠。

表2 蒲公英根多酚對腦損傷小鼠血清的SOD、CAT 酶活力和MDA 水平的影響(±s)

表2 蒲公英根多酚對腦損傷小鼠血清的SOD、CAT 酶活力和MDA 水平的影響(±s)

注：a、b、c 分別代表正常組、TRPH 組和 TRPL 組與模型組相比具有顯著差異（P<0.05）

8.91±0.62a 20.97±1.22 15.27±1.08c 11.02±0.76b組別 SOD (μmol/L) GSH-Px (U/ml) MDA (nmol/ml)正常組模型組TRPL 組TRPH 組210.85±19.22a 104.39±10.82 139.80±11.26c 173.52±15.48b 221.08±17.39a 80.34±6.82 112.05±12.34c 186.37±15.27b

圖1 蒲公英根多酚對腦損傷小鼠腦組織SOD1、CAT、cAMP 和 p-CREB 蛋白表達(dá)的影響

3 討論

沖擊性腦損傷對中樞神經(jīng)系統(tǒng)造成的損傷不僅對行動、認(rèn)知產(chǎn)生影響，還可能促使學(xué)習(xí)、記憶和性格等發(fā)生變化[7]。 體現(xiàn)在動物實(shí)驗(yàn)上腦損傷將導(dǎo)致小鼠在空間學(xué)習(xí)能力、 記憶能力和新物體識別能力上顯著區(qū)別于正常狀態(tài)[8]。 本研究中腦損傷小鼠也出現(xiàn)相同狀態(tài)，通過TRP 灌胃，可以顯著改善這些情況。

腦損傷導(dǎo)致腦組織發(fā)生氧化應(yīng)激， 氧化平衡失調(diào)又會使腦損傷程度加劇[9]。SOD 和CAT 是體內(nèi)的抗氧化酶， 能夠起到抑制氧化應(yīng)激的作用，而MDA 是脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物[10,14,15]。 SOD、CAT 酶活力和MDA 水平被常作為評價機(jī)體氧化程度的指標(biāo)[11]。本研究中腦損傷小鼠血清的SOD（SOD1）和GSHPx 酶活力和蛋白， 還有MDA 水平均出現(xiàn)異常，TRP 通過調(diào)節(jié)他們起到了抑制氧化應(yīng)激， 保護(hù)腦組織的作用。

環(huán)磷酸腺苷（cAMP）具有調(diào)節(jié)物質(zhì)代謝和神經(jīng)功能的作用， 可以作為信號傳遞物質(zhì)， 對組織損傷、 缺血和缺氧的進(jìn)行調(diào)節(jié)，cAMP Protein Kinase Catalytic subunit（cAMP 蛋白激酶催化亞基）是激活cAMP 的必要因子[12]。 環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白（CREB），是調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)，在腦細(xì)胞中大量分布, 是大腦保持記憶力的特殊蛋白質(zhì)[16]。cAMP/CREB/BDNF 信號通路正常可以保持中樞神經(jīng)的活動， 該通路也對大腦的學(xué)習(xí)和記憶力有直接影響[17]。本研究中也發(fā)現(xiàn)腦損傷小鼠中的cAMP Protein Kinase Catalytic subunit 和 p-CREB 蛋白表達(dá)低于正常狀態(tài)，TRP 能夠上調(diào)這兩個蛋白表達(dá)，修復(fù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)，減輕腦損傷。

本研究通過動物實(shí)驗(yàn)充分證明了TRP 對腦組織有明顯的保護(hù)作用， 可以減輕腦損傷及腦損傷引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)。 由此可以看出TRP 具有進(jìn)一步開發(fā)作為臨床藥物的潛質(zhì)。