全胚冷凍周期胚胎復蘇后空泡對妊娠結局的影響

朱家紅，武麗紅，熊順，高洋，黃國寧

(人類胚胎工程重慶市重點實驗室，重慶市遺傳與生殖研究所，重慶市婦幼保健院，重慶 400013)

凍融胚胎移植(FET)是輔助生殖技術(ART)中冷凍保存胚胎、解凍復蘇后再移植回子宮的一種技術。FET周期相對于控制性卵巢刺激(COS)鮮胚移植周期，子宮內膜發育和內膜準備控制得更精細，可形成更好的內膜容受性[1]，改善種植結局。目前大部分患者由于囊胚培養的不確定性，仍選擇全部卵裂期胚胎冷凍或凍存部分卵裂期優質胚胎，剩余胚胎則繼續進行囊胚培養。隨著全胚冷凍周期率越來越高，FET后的妊娠結局也備受關注。胞質空泡形成是胚胎體外培養過程中胞質異常的常見現象，可見于植入前胚胎發育的各個階段以及冷凍解凍后的胚胎。本單位之前文獻報道COS周期鮮胚移植中有空泡現象的胚胎表現出與種植率和妊娠結局無顯著相關性的特點[2]，我們將空泡作為其中一個因素參與胚胎評分，COS周期中僅空泡較少的胚胎且空泡直徑<14 μm的胚胎用于移植或冷凍；研究發現冷凍有小空泡的胚胎解凍后通常空泡體積會變大、數量會增多，隔夜培養后本無空泡的胚胎也可能產生較多空泡甚至整個胚胎空泡化。因此，本研究對這類胚胎移植后的臨床結局進行分析，將有助于判斷解凍復蘇胚胎的種植潛能以及是否需要再次解凍剩余胚胎移植。

資料與方法

一、研究對象

回顧性分析2017年1月至2019年12月于重慶市遺傳與生殖研究所就診的行FET周期患者的臨床資料。納入標準：首次助孕且均為COS全胚冷凍周期；第1次行FET；子宮內膜厚度≥8 mm；胚胎時期為第3天(D3)胚胎。排除標準：微刺激方案；解凍后有胚胎卵裂球壞死、發育停滯的周期；合并存在影響胚胎種植的因素，如子宮內膜異位癥、子宮腺肌癥和宮腔積液。根據納入/排除標準，由于FET移植2枚胚胎均有空泡的周期以及單胚胎移植且有空泡的周期樣本量太小不納入本次分析，因此本研究僅包括移植2枚D3胚胎且其中1枚有空泡的周期。

共納入3 528個周期，其中胚胎冷凍復蘇當時和隔夜培養后均無空泡形成的周期2 615個，為無空泡組；解凍復蘇時即存在空泡的312個周期，為解凍時空泡組；復蘇時無空泡，隔夜培養后出現空泡的601個周期，為培養后空泡組。根據移植時空泡卵裂球胚胎占卵裂球胚胎總數的比例分為兩組，<30%組679個周期，≥30%組234個周期。

二、研究方法

根據患者情況選擇適合的控制性促排卵方案、授精方式，常規進行胚胎培養。根據臨床評估對于不適合鮮胚移植的患者行可利用胚胎全胚冷凍。冷凍胚胎選擇標準：受精后第3天胚胎細胞數≥6，碎片<35%，卵裂球大小基本均勻。

1.胚胎冷凍和復蘇：胚胎冷凍解凍均使用Kitazato試劑盒(加藤公司，日本)，按照說明書進行嚴格操作。冷凍操作時將胚胎放置于平衡液(equilibrium solution，ES)表面，室溫下放置9～15 min，當胚胎恢復至最大程度時移入玻璃化冷凍液(vitrification solution，VS)中，反復吸放，1 min內將胚胎以最小液滴裝載于冷凍載體上，液氮保存。胚胎解凍復蘇時將冷凍載體取出，將胚胎置于試劑盒1液中1 min，2液中3 min，3液和4液中各5 min，待胚胎形態恢復后于囊胚培養液vitrolife G1中隔夜培養至第2天移植。

2.人工周期內膜準備方案：患者于月經周期的第 2～5天開始口服補佳樂(廣州拜耳醫藥)準備內膜，連續用藥14 d后B超監測子宮內膜厚度，內膜厚度達標后(≥7 mm)予黃體酮轉化內膜，3 d后移植卵裂期胚胎。

3. 觀察指標：冷凍前優質胚胎率=優質胚胎數/解凍胚胎數×100%；種植率=孕囊數/移植胚胎數×100%；臨床妊娠率=臨床妊娠周期數/移植周期數×100%；流產率=流產周期數/臨床妊娠周期數×100%。

4. 妊娠判斷：移植后14 d行血清HCG檢測，移植后24 d超聲檢查見孕囊、胚芽，移植后35 d超聲檢查心管搏動者確定為臨床妊娠。

三、統計學分析

結 果

一、空泡發生時間對臨床結局的影響

解凍時空泡組312個周期，培養后空泡組601個周期，無空泡組2 615個周期，3組之間年齡、體重指數(BMI)、不育原因、基礎性激素水平、子宮內膜厚度及冷凍前優質胚胎率比較均無顯著性差異(P>0.05)。但解凍時空泡組種植率顯著低于無空泡組和培養后空泡組(P<0.05)；解凍時空泡組FET日空泡卵裂球胚胎比例顯著高于培養后空泡組(P<0.05)；3組之間臨床妊娠率和流產率比較均無顯著性差異(P>0.05)。培養后空泡組與無空泡組相比各指標比較均無顯著性差異(P>0.05)(表1)。

表1 空泡發生時間對妊娠結局的影響[(-±s)，%]

二、FET時空泡卵裂球胚胎比例對妊娠結局的影響

<30%組679個周期，≥30%組234個周期，無空泡組2 615個周期。3組之間年齡、不育因素、基礎性激素水平、子宮內膜厚度、冷凍前優質胚胎率及流產率比較均無顯著性差異(P>0.05)。≥30%組分別與其他兩組比較，種植率和臨床妊娠率均顯著降低(P<0.05)；<30%組與無空泡組比較各指標均無顯著性差異(P>0.05)(表2)。

表2 FET時空泡卵裂球胚胎比例對妊娠結局的影響[(-±s)，%]

討 論

一、空泡形成的原因和機制

空泡形成是胚胎體外培養過程中胞質異常的常見現象，但空泡形成的原因和機制目前尚無定論。主要原因有：胞質發育不成熟[3]，患者自身年齡、基因表達異常以及體外培養環境影響[4]。有學者推測空泡是由卵泡膜不穩定或閉鎖造成的異常內吞作用所致，其內充滿與卵周隙內成分相同的液體[5]。

二、空泡發生時機對胚胎發育及臨床結局的影響

空泡對胚胎發育的影響存在爭議，且將空泡作為獨立因素分析其對胚胎發育和妊娠結局影響的研究更少。多個研究發現卵母細胞內空泡可能會影響細胞骨架功能的發揮，從而顯著影響受精[6-7]和正常的細胞卵裂過程，甚至導致胚胎發育阻滯[6，8]。有研究表明卵母細胞和卵裂期胚胎的胞質空泡顯著影響囊胚形成率和優質囊胚率[6，9-10]；認為胞質空泡可作為臨床預后不良的指標[11]。但也有研究認為卵母細胞和卵裂期自發空泡的形成并不降低早期胚胎的質量及發育潛能[12]。即使卵母細胞胞質內含有大量的空泡仍具有正常受精和發育為健康胎兒的能力[13]。

研究顯示胚胎致密化階段是空泡形成的高峰期，優質胚胎在受精后第4天出現空泡的陽性率為42.6%[14]，因此空泡形成可能是胚胎致密化后促進融合形成囊胚的另一種方式[6，15]。且研究發現第5天大部分的空泡存在于滋養層細胞中，內細胞團中存在的空泡似乎存在自我修復機制[6，16]。有空泡的卵裂球可能不會參與胚胎致密化過程或少量的卵裂球參與并不會影響整個胚胎繼續發育的能力，但如果空泡化的卵裂球位于緊密連接細胞之間時可能會影響其它正常細胞之間的連接[14]。2016年Nottola等[17]通過透射電子顯微鏡研究發現所有冷凍的卵母細胞復蘇過程中均出現胞質空泡形成的現象，且在解凍復溫中期空泡直徑達到最大，而新鮮的正常成熟卵母細胞則不會出現類似情況，由此推測凍融過程中發生胞質空泡化可以認為是結構損傷的表現形式以及卵母細胞對冷凍損傷的應激反應。本研究對空泡出現的時機進行分析，結果表明解凍時空泡組FET日空泡卵裂球胚胎比例顯著高于培養后空泡組，且FET后對胚胎種植的影響較大，提示胚胎冷凍復蘇過程中由于冰晶的形成導致細胞器損傷，空泡的形成可能是損傷的細胞器的聚集。研究結果還顯示培養后空泡組的種植率、臨床妊娠率及流產率與無空泡組比較無顯著性差異，提示隔夜培養后空泡出現未明顯影響胚胎種植潛能，說明此階段產生的少量空泡可能是胚胎融合的一種方式，或者已形成的空泡在囊胚形成的過程中被吸收或者被排出胚胎外。

三、空泡多少對胚胎發育及臨床結局的影響

大部分胞質空泡的研究未區分空泡的大小和數量以及是否合并其它的胞質異常，僅少量文獻對空泡的大小和數量有報道。Ebner等[6]研究發現當空泡直徑≥14 μm會顯著影響卵母細胞的受精能力。Zhang等[14]通過時差顯微鏡觀察空泡胚胎的發育潛能，發現胚胎中含空泡的卵裂球越多胚胎的發育能力越差。本研究通過計算有空泡卵裂球占胚胎卵裂球總數的比例探討空泡卵裂球的多少對胚胎種植的影響，結果表明FET日空泡卵裂球胚胎比例≥30%時移植后種植率顯著下降，但流產率尚無顯著性差異。

目前全胚冷凍患者在無特殊情況下均選擇移植兩枚卵裂期胚胎以提高妊娠率，胚胎冷凍解凍過程對胚胎的損傷無法避免，解凍時胚胎中存在的空泡經隔夜培養后空泡卵裂球胚胎比例會顯著增多，且當空泡卵裂球胚胎比例≥30%時會顯著影響胚胎的種植潛能，因此移植前可以參考空泡卵裂球胚胎比例和出現時機考慮是否需要解凍剩余胚胎移植。