50例胚胎植入前遺傳學診斷的臨床資料分析

陳蕾，李敏，黃影，揣云海，舒明明，朱海燕

(中國人民解放軍總醫院第六醫學中心婦產科，北京 100048)

遺傳性疾病是威脅人類健康的主要疾病之一，可導致嚴重的出生缺陷。胚胎植入前遺傳學診斷(Preimplantation genetic diagnosis，PGD)是在體外受精-胚胎移植(IVF-ET)技術的基礎上，對具有遺傳性疾病風險夫婦的卵母細胞或者植入前的胚胎進行活檢，利用分子生物學技術對胚胎進行遺傳學檢測，篩選出無遺傳性疾病的胚胎進行植入[1]。PGD主要針對已經明確病因的遺傳性疾病家系，在種植前對胚胎進行相應的遺傳學診斷，主要包括單基因病(如地中海貧血、遺傳性耳聾等)和染色體病(如羅氏易位、平衡易位等)，選擇沒有發病風險的胚胎移植，一方面可以從源頭上杜絕患病兒出生，另一方面也可以避免因反復人工流產或引產導致的身體和精神上的創傷[2-3]。本研究通過對40例染色體病和10例單基因病患者的PGD臨床資料進行詳細分析，以期為今后此類患者的診療及遺傳咨詢提供一定依據。

資料與方法

一、研究對象

選取2017年1月至2019年1月在解放軍總醫院第六醫學中心婦產科生殖中心就診并完成IVF/ICSI助孕周期及PGD的50對夫婦，其中40例是夫妻之一為染色體結構異常攜帶者，10例為單基因病家族史、夫妻一方或雙方為致病基因攜帶者。對患者的臨床資料進行回顧性分析。

二、研究方法

1.IVF/ICSI-ET方案：所有患者均采用本中心制定的常規促排卵方案，如長方案、拮抗劑方案、微刺激方案、高孕激素狀態下促排卵方案(PPOS方案)及短方案等。所用的促排卵藥物為重組人卵泡刺激素(r-hFSH，默克，德國)，拮抗劑為西曲瑞克(思澤凱，默克，德國)，長方案所用的降調藥為促性腺激素釋放激素激動劑(GnRH-a，曲普瑞林，達菲林，益普生，法國)。行B超檢查監測卵泡發育情況，當卵泡直徑≥18 mm時，給予人絨毛膜促性腺激素(HCG，默克，德國)10 000 U肌肉注射。34～36 h后，在B超引導下進行負壓抽吸取卵。

2.胚胎培養：將受精卵放入卵裂期培養液進行培養，液滴大小20 μl，每個液滴放入3～5個卵裂期胚胎，放入三氣培養箱進行培養。培養至第3天將卵裂期胚胎轉移入事先經CO2平衡的囊胚培養液進行囊胚培養，每個液滴(20l)放1個胚胎，放入三氣培養箱繼續培養，培養至第5天(D5)、D6后，根據Gardner評分標準對囊胚進行評分。

3.囊胚期活檢：選取D5或D6囊胚進行滋養外胚層活檢，選擇內細胞團對側采用激光破膜系統在透明帶上打孔，之后繼續培養4～6 h，使部分滋養層形成疝后更利于囊胚活檢。活檢時，讓內細胞團位于固定針一側，活檢針靠近形成疝的外滋養層細胞緩慢回吸，并利用激光打孔，直至活檢的外滋養層細胞全部脫離囊胚，活檢后囊胚繼續培養30 min后冷凍保存。活檢組織在配子緩沖液中清洗后裝入含有2 μl單細胞裂解液的PCR管中，-20℃冷凍保存待用。所有囊胚活檢后依據活檢報告進行單囊胚移植。

4.單細胞全基因組擴增：應用多次退火環狀循環擴增法(multiple annealing and looping-based amplification cycles，MALBAC)技術，對活檢細胞進行全基因組擴增(whole-genome amplification，WGA)。采用單細胞WGA試劑盒(江蘇億康公司)，按照操作說明，依次經過細胞裂解、預擴增、指數擴增步驟進行擴增。

5.染色體拷貝數分析：單細胞WGA擴增后的每個樣本產生約2 M reads的數據量，使用Illumina HiSeq 2500平臺，采用二代測序技術(Next generation sequencing，NGS)檢測胚胎染色體拷貝數，計算每個窗口的reads數目，并使用R語言對每個窗口的GC矯正之后的reads 數目進行作圖，使拷貝數變異可視化。

6.單基因病胚胎植入前遺傳學檢測(PGT)：10個單基因病家系先證者的基因診斷均在我院產前診斷中心完成，明確致病基因突變。不同基因的檢測方法不同，例如杜氏肌營養不良(Duchenne muscular dystrophy，DMD)家系的缺失突變采用多重連接依賴探針擴增(Multiple Ligated Probe Amplification，MLPA)方法檢測，SCA3家系采用熒光定量PCR(qf-PCR)方法檢測，其他家系的點突變采用sanger測序法。單細胞WGA擴增后，除針對不同家系進行致病基因變異位點檢測之外，同時針對該病例涉及基因所在染色體多個單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism，SNP)位點進行檢測，對胚胎及家系的進行單體型分析，協助明確胚胎基因型。

7.產前診斷：所有孕婦在妊娠18～22 W進行羊水穿刺，產前診斷，對胎兒進行核型分析及基因檢測，再次復核患者核型和基因型。

三、統計學分析

結 果

一、染色體病患者PGD臨床資料

40例染色體病家系中女方年齡25～43歲，平均(33.9±4.4)歲，共有6種染色體病，分別為平衡易位、倒位、羅氏易位、白血病骨髓移植后和多態性等。其中30例為平衡易位(男性17例，女性13例)，4例羅氏易位(男性3例，女性1例)，3例倒位(男性2例，女性1例)，2例反復胚胎停育(男方染色體多態)，1例男性白血病骨髓移植后。最常見的病史為胚胎停育史(21例)，占52.5%(21/40)；其次為原發不孕(14例)，占35.0%(14/40)(表1)。

表1 染色體病夫婦資料信息

40例染色體結構異常攜帶者病例共進行了49個促排卵周期，形成了150個囊胚，全部采用囊胚活檢，成功率為100%。每個患者獲卵數為1～12個，平均(3.8±3.1)個；經過PGD診斷后獲得可移植囊胚總數為39個，60%的患者獲得了可移植的囊胚(24/40)，每個患者獲得可移植囊胚數目范圍是0～9個，平均為(1.0±1.5)個。均為單囊胚移植，移植20人。臨床妊娠12人，流產2例，分娩10人，其中6例男嬰(剖宮產4例，順產2例)，4例女嬰(剖宮產3例，順產1例)。所有孕婦在孕中期均行羊膜腔穿刺產前診斷，核型分析均未見染色體拷貝數目異常。妊娠率60.0%(12/20)，分娩率50.0%(10/20)(表2)。

表2 染色體病患者PGD臨床資料

二、單基因病患者PGD臨床資料

10例單基因病家族史患者中，女性年齡23～38歲，平均(34.0±4.8)歲。共有7個病種，其中常染色體顯性遺傳性多囊腎3例，血友病2例；最常見的病史為不良產史和原發不孕各4例，其次為有家族史的患者2例(表3)。

表3 單基因病患者臨床資料信息

10例單基因病患者進行了13個促排卵周期，獲得了68個囊胚并進行了檢測，全部采用囊胚活檢，成功率為100%。每個患者獲卵數為1～10個，平均(6.8±3.4)個，經過PGD基因檢測共獲得了24個可移植囊胚，每個患者獲得可移植囊胚數目范圍0～5個，平均為(2.4±1.8)個。全部采用單囊胚移植，移植9人，臨床妊娠5人；孕中期產前診斷，胎兒染色體核型均正常，單基因病家系胎兒基因型與PGD結果相符。1例孕24 W時自然流產；1例至文章撰寫時孕30 W；3例足月剖宮產，均健康。持續妊娠率55.6%(5/9)，分娩率33.3%(3/9)(表4)。

表4 單基因病患者PGD臨床資料

討 論

Handyside等[4]最早在1990年首次將PGD技術應用于臨床，為5對X連鎖隱性遺傳病的夫婦進行胚胎移植前診斷，最終有2對夫婦獲得了健康的雙胎女嬰。隨后這項技術迅速發展，特別是結合了輔助生殖技術，對有遺傳高風險的夫婦進行PGT，可大大降低出生缺陷的發生[5]。目前針對胚胎染色體的PGT，根據檢測目，分為PGT非整倍體檢測(PGT for aneuploidy，PGT-A)、PGT染色體結構異常檢測(PGT for chromosome structural rearrangements，PGT-SR)和PGT單基因病檢測(PGT for single gene/monogenic disorders，PGT-M)，PGT-A主要可檢測胚胎非整倍體、染色體部分缺失/重復(通常≥4 Mb)，PGT-SR可以了解胚胎的染色體是否存在結構變異，即了解胚胎是否遺傳了親代染色體的易位、倒位等結構異常。PGT-M用于單基因病的植入前檢測[6-7]。

染色體數目或結構異常所導致的疾病稱為染色體疾病。有研究對流產、死產及新生兒和一般人群進行調查，結果顯示染色體異常占流產胚胎的50%，占死產嬰兒的8‰，占新生兒死亡者的6‰[8]。在一般人群中相互易位占2‰左右，在染色體病中排在第1位；排在第2位的是羅氏易位，人群中頻率約為1‰，其中15%生育力低下。在自然流產夫婦中，易位的發生率顯著增高，可達5%～10%[9]。相互易位由于沒有遺傳物質的丟失，本人無異常表型，但在其配子形成的減數分裂過程中，同源染色體重組可形成多種類型的遺傳物質不平衡的配子，生育染色體異常后代幾率達到50%～100%，嚴重影響生育。PGT-SR的出現，給這類患者帶來了希望。Butler等[10]曾研究了28例PGT-SR患者，發現在IVF促排卵的過程中，60.7%的患者至少有1個正常的胚胎，胚胎移植后累積妊娠率為87.5%，持續妊娠或分娩率為42.9%。本研究的40例患者中，60%的患者有可移植胚胎，累計妊娠率為60.0%，與前述文獻比較，此兩項指標相似，但本研究中分娩率(50.0%)更高一些。當然分娩率的高低和PGT-SR結果、卵子數量、檢測的囊胚數及適宜移植胚胎數等均有顯著的相關性[11]。國際上多數生殖中心，PGT后每次胚胎移植的臨床妊娠率約為40%[2]，本研究數據略高于國際平均數據，這可能與我們的病例數少有關。

單基因病是由一對等位基因控制并因單個基因突變引起的疾病，一般涉及單個核苷酸到整個基因的改變。根據致病基因所在染色體及基因表現型的不同可以把孟德爾遺傳病分為常染色體(autosomal)遺傳和性連鎖(sex-linked)遺傳兩大類，兩者又分為顯性遺傳和隱性遺傳兩種。單基因病的發病主要在嬰幼兒、青少年時期，青少年后期發病者不到10%，最主要的臨床表現是智力障礙、生長發育遲緩、單器官或者多器官發育異常、聽力或者神經、血液系統損害等[12]。因此很多夫婦因單基因病生育史，部分因單基因病家族史而就診，甚至部分夫妻因家族中有基因病患者不敢生育，對家庭造成嚴重影響。經過PGT-M，可了解胚胎目的基因的基因型，選擇沒有發病風險的胚胎移植，以避免子代發病[13]；對于性連鎖的遺傳病，還可以通過對胚胎性別進行鑒定，以避免子代發病的可能[14]。我們實驗室對有血友病家族史的夫婦采用PGT-A結合PGT-M，選擇染色體平衡且未遺傳致病基因的胚胎植入，可以獲得健康嬰兒。

目前針對單基因病的PGD技術發展非常快。本研究采用MALBAC擴增測序的PGD，為了減少單細胞PCR中的高等位基因丟失的發生率，同時引入了胚胎植入前遺傳學單體型分析(preimplantation genetic haplotyping，PGH)技術。該技術通過對多個SNP位點進行檢測，并結合家系SNP單體型連鎖分析的策略，可以從理論上為模板中等位基因丟失的問題提供解決方案。

近年來，隨著PGD技術在各學科領域的擴大應用和發展，越來越多的學者開始關注PGD子代的安全問題和倫理問題。Winter等[15]曾在研究中對經PGD獲得活產(47例)、經ICSI獲得活產(49例)及自然妊娠后分娩(48例)的5～6歲兒童的認知發育和運動能力進行隨訪評估，結果顯示PGD組兒童的兩項指標和其他兩組比較并無顯著性差異，而自然妊娠組兒童和ICSI組兒童的運動能力比較存在顯著性差異。本研究納入的50例樣本人群中共分娩獲得新生兒13例，隨訪均無明顯出生缺陷發生；1例孕30 W，產檢胎兒健康。但PGD安全問題的探討，涉及的內容比較多，也比較復雜，包括胚胎活檢、活檢的時期、活檢的方法及部位等，仍需要更長久和更多的病例分析來完成，還需進一步擴大樣本量以支持本文結論。

總之，PGD技術的出現為染色體疾病的夫婦帶來了希望，由于本中心開展PGD工作量不大，診療病種不多，需積累更多的病例，一起為臨床提供更多的參考。NGS技術可以有效篩查出攜帶染色體病和單基因病的囊胚，避免移植此類囊胚，阻斷遺傳病的傳遞。