時差成像系統對囊胚培養及妊娠結局的影響

高洋，劉軍霞，朱家紅，韓偉，黃國寧

(重慶市婦幼保健院遺傳與生殖研究所，重慶 400013)

隨著人類輔助生殖技術(ART)不斷發展，囊胚培養的應用更加廣泛。移植囊胚階段的胚胎與卵裂期胚胎相比，可以提高胚胎與子宮內膜容受的同步性，增加對胚胎的體外篩選并獲得更好的妊娠率和著床率[1-4]。但囊胚培養延長了胚胎在體外的培養和暴露時間，因此，對實驗室的體外培養體系有更高要求，優良的體外培養條件是促進囊胚形成的重要因素之一[5-6]。

時差成像系統(time-lapse imaging，TLI)是近年來發展的一種新的無創胚胎培養與評估體系，能實時觀察從胚胎受精開始到其移植的連續動態分裂圖像。并且與傳統培養體系相比，TLI能夠避免胚胎被多次移出培養箱觀察，為胚胎發育提供了更穩定的溫度、濕度、PH值及氣體含量等培養條件。研究表明TLI能為胚胎培養提供安全穩定的培養環境，更好地預測胚胎的發育潛能并改善卵裂期胚胎的妊娠結局[7-10]。TLI的這些優勢為囊胚培養提供了新的思路，本研究通過比較TLI與常規培養系統的囊胚培養效果及囊胚移植后的妊娠結局，旨在提高囊胚形成率、優化囊胚培養方案。

資料與方法

一、研究對象

回顧性分析2017年1月至2018年12月在本中心接受ART治療并行囊胚培養的不孕患者的臨床資料。

納入標準：女方年齡<40歲；單純輸卵管因素不育；第1次行囊胚培養并在獲得可利用囊胚后行全囊胚冷凍，待內膜準備后移植凍融囊胚的患者。排除標準：排除子宮及宮腔病變、男方精液異常、夫妻雙方患染色體疾病的患者。所有患者均自愿進行囊胚培養并簽署了囊胚培養知情同意書。

本研究共納入481例不孕患者(481個周期)，根據囊胚培養方式不同分為采用TLI系統進行囊胚培養的TLI組(n=189)和采用傳統培養體系培養囊胚的標準培養系統(SI)組(n=292)。

二、研究方法

1.促排卵、取卵、受精：所有患者均采用我中心的標準長方案[11]進行促排卵，當至少3個主導卵泡直徑達到18 mm時，于當晚注射HCG(Ovidrel，Merck Serono，意大利)5 000～10 000 U，36～38 h后在陰道超聲引導下行穿刺取卵。獲得的卵冠丘復合物在2.5 ml G-IVF培養液(Vitrolife Sweden AB，瑞典)中培養至受精。對所有患者行常規IVF，即HCG注射后39～40 h將卵母細胞加入約含10 000～15 000條精子的精子滴內共同培養，18 h后去除卵母細胞外顆粒細胞，顯微鏡下觀察出現兩個原核視為正常受精。

2.囊胚培養及評分：(1)TLI培養系統：將正常受精的合子轉入含G-1培養液(Vitrolife Sweden AB，瑞典)的TLI專用培養皿(EmbryoSlideTM，Unisense Fetilitech，丹麥)中，放置于TLI(EmbryoScopeTM，Unisense Fertilitech，丹麥)培養系統中培養至受精后66～68 h(D3)，暫停圖像，取出培養皿，將G-1培養液吸盡換成囊胚G-2培養液(Vitrolife Sweden AB，瑞典)，再次放入TLI系統中培養至113～139 h(D5～D6)。TLI系統每5 min記錄1次胚胎圖像并生成動態胚胎發育視頻，根據視頻圖像結合Peter卵裂期胚胎評分系統[12]和Gardner囊胚評分系統[13]進行胚胎評分和選擇。將D3發育至4～10個卵裂球，評級為Ⅰ～Ⅲ級的胚胎定義為可利用胚胎，評級標準如下：Ⅰ級：卵裂球大小均勻、形狀規則、胞質均勻、無顆粒現象、碎片<10%；Ⅱ級：卵裂球大小稍不均勻、形狀稍不規則、胞質有少量顆粒、碎片10%～20%；Ⅲ級：卵裂球不均勻、形狀不規則、胞質有明顯顆粒現象、碎片20%～50%；Ⅳ級：卵裂球嚴重不均勻、形狀嚴重不規則、胞質有嚴重顆粒、碎片>50%。囊胚評級根據囊腔擴張程度分為1期(囊胚腔小于囊胚體積的50%)、2期(囊胚腔超過囊胚體積的50%)、3期(囊胚腔充滿整個囊胚)、4期(囊胚擴張、體積變大并透明帶變薄)、5期(囊胚部分從透明帶孵出)和6期(囊胚完全孵出)。對3～6期的囊胚再根據內細胞團和滋養層細胞進行評級：內細胞團A級為細胞數量多且分布緊密，B級為細胞數量較少且松散，C級為細胞數量極少；滋養層A級為細胞較多且連接緊密，B級為細胞少且連接松散，C級為細胞極少。(2)SI培養系統：將正常受精的合子轉入含G-1培養液的Nunclon細胞培養皿(NunclonTM，Nunc，丹麥)中，放置于常規培養箱(SANYO，MCO-5M，日本)中進行培養，并于受精后44～46 h(D2)、66～68 h(D3)分別取出，在顯微鏡下觀察并記錄胚胎評分情況，將D3可利用胚胎(4細胞Ⅲ級以上胚胎)轉入囊胚G-2培養液中，再次放入常規培養箱中培養至受精后113～115 h(D5)及137～139 h(D6)觀察囊胚形成情況。參照Gardner囊胚評分標準，將D5或D6評級高于3CC的囊胚定義為可利用囊胚。囊胚擴張程度達到或高于3期(即3、4、5、6期)，內細胞團和滋養層細胞達到BB級及以上(包括AA、AB、BA、BB)的囊胚視為優質囊胚。

3.囊胚冷凍、復蘇與移植：對所有可利用囊胚行激光打孔人工皺縮后，采用商品化冷凍與復蘇液(Kita，Toyota，日本)按照試劑盒提供方法進行囊胚冷凍與復蘇。患者在囊胚冷凍3個月經周期后采用人工周期的方法準備內膜，當內膜厚度達到7 mm以上時加用孕激素(Crinone，Merck Serono，丹麥)轉化子宮內膜，并于第5天選擇復蘇囊胚1～2枚。兩組患者均按D5優質囊胚、D6優質囊胚、D5可利用囊胚、D6可利用囊胚的順序選擇復蘇囊胚。TLI組在此順序基礎上再結合動態圖像優先選擇復蘇細胞期階段不存在直接卵裂模式的優質或可利用囊胚，即D5優質囊胚如出現直接卵裂則選擇復蘇D6優質囊胚，依此類推。直接卵裂模式包括1細胞直接卵裂至3細胞(1至3細胞卵裂)和2細胞直接卵裂至5細胞(2至5細胞卵裂)(圖1)。復蘇囊胚轉入G-2培養液中培養2～4 h等待移植，移植前觀察囊胚完全擴張或未擴張但50%以上細胞存活即可在腹部B超引導下行囊胚移植。

A：1細胞直接卵裂至3細胞；B：2細胞直接卵裂至5細胞圖1 直接卵裂模式示意圖

4.觀察指標：主要觀察指標為囊胚形成率、可利用囊胚率、優質囊胚率、臨床妊娠率、著床率和流產率。囊胚形成率=囊胚形成數/培養囊胚數×100%；可利用囊胚率=可利用囊胚數/培養囊胚數×100%；優質囊胚率=優質囊胚數/培養囊胚數×100%；臨床妊娠率=臨床妊娠患者數/移植周期數×100%；著床率=孕囊數/總移植胚胎數×100%；流產率=早期自然流產患者數/臨床妊娠患者數×100%。臨床妊娠率和著床率是以胚胎移植后5周通過超聲檢查探及宮內孕囊為標準。早期自然流產是指臨床妊娠12周之前的妊娠丟失。

三、統計學分析

結 果

一、兩組患者的一般資料比較

兩組患者的年齡、體重指數(BMI)、抗苗勒管激素(AMH)水平、不孕年限、Gn總量、獲卵數及轉化日內膜厚度比較均無顯著性差異(P>0.05)(表1)。

表1 兩組患者的一般資料比較(-±s)

二、兩組患者的囊胚培養結局比較

兩組患者的受精率、2PN卵裂率和D3可利用胚胎率、囊胚形成率、可利用囊胚率和優質囊胚率比較均無顯著性差異(P>0.05)(表2)。

表2 兩組患者囊胚培養結局比較(%)

三、TLI組胚胎直接卵裂結果

TLI組形成的可利用囊胚中有39枚來源于1細胞直接卵裂為3細胞的胚胎，有20枚來源于2細胞直接卵裂至5細胞的胚胎，分別占可利用囊胚的比率為4.11%(39/949)和2.11%(20/949)。共有3例患者移植的囊胚中含有直接卵裂來源的胚胎：其中1例患者僅獲1枚可利用囊胚并來源于1細胞直接卵裂為3細胞的胚胎，移植后未妊娠；另2例患者均獲2枚囊胚，其移植的2枚囊胚中分別含有1枚1細胞直接卵裂為3細胞的胚胎和1枚2細胞直接卵裂為5細胞的胚胎，均獲得1個著床孕囊。

四、兩組患者移植囊胚質量比較

截至2019年12月31日，共有360例患者入院接受復蘇囊胚移植，其中TLI組143例，SI組217例。兩組間移植囊胚數、移植優質囊胚率、移植D5及D6囊胚率比較均無顯著性差異(P>0.05)；兩組中移植D5囊胚率均顯著高于同組移植D6囊胚率(P<0.05)(表3)。

表3 兩組患者移植囊胚質量比較[(-±s)，%]

五、兩組患者臨床結局比較

TLI組移植后的臨床妊娠率和著床率均顯著高于SI組(P<0.05)；兩組患者的流產率比較無顯著性差異(P>0.05)(表4)。

表4 兩組患者妊娠結局比較(%)

討 論

TLI作為新的胚胎培養與評分系統，因其穩定可控，并能夠提供胚胎動力學參數的優勢明顯，已越來越廣泛地應用在卵裂期胚胎的培養與選擇中。目前已有較多文獻報道采用TLI進行卵裂期胚胎培養的效果及妊娠結局優于傳統培養箱[9，14-16]，也有研究表明TLI得出的卵裂期胚胎動力學參數能夠預測囊胚的形成率及囊胚質量[17-18]，而TLI直接應用于囊胚培養效果的評價甚少。本研究比較了采用TLI與SI行囊胚培養的效果，結果顯示兩者的囊胚形成效果相似，但移植TLI培養形成囊胚的臨床妊娠率和著床率均顯著高于傳統培養系統。Pribenszky等[14]通過meta分析，提出移植TLI系統培養的胚胎能夠獲得更高的臨床妊娠率和更低的流產率。Alhelou等[10]研究發現與TLI培養系統相比，普通培養箱中培養的胚胎早期發育未受影響，但從D3開始的后期發育受不穩定培養條件的影響逐漸顯現，結果顯示TLI中培養的囊胚移植后著床率更高。

TLI可以避免胚胎被移出觀察時多次開關培養箱造成的培養環境改變，能為胚胎發育提供更穩定的外環境，為卵裂期胚胎的培養提供了更好的選擇。但因為本研究中將胚胎培養至囊胚期采用的是序貫培養基，因此需在第3日將胚胎移出換液，無法使囊胚在整個過程中培養環境保持恒定。另一方面TLI的安全性亦存在爭議，為了獲得連續的胚胎發育圖像，TLI中圖像采集系統會定時對胚胎進行拍照，這種周期性光源照射可能會對胚胎發育產生危害[19]。但是已有研究報道采用TLI培養并移植的胚胎能夠獲得健康活產嬰兒[15，20]，提示TLI可能并不影響胚胎發育，但其觀察系統的安全性仍有待進一步評估。這些影響因素可能是本研究結果中TLI組囊胚形成率、可利用囊胚率及優質囊胚率未顯著高于SI組的原因。

本研究中兩組患者均根據Gardner囊胚評分系統對囊胚進行形態學上的評分和選擇，TLI組中由于提供了胚胎動態發育圖像，使我們能夠獲得更多參考指標，包括各種時間參數和卵裂模式。目前國內外針對這些動態參數運用于胚胎選擇的研究甚多，但哪些指標效果最佳仍無定論。近期，胚胎異常卵裂模式中的直接卵裂受到了很多關注。一些研究表明，由直接卵裂發育而來的胚胎發育潛能低下、種植率和出生率降低、流產率增高，但此種類型的胚胎可能在形態學上并未表現出明顯異常，亦可發育成為可利用囊胚，因此通過傳統培養方式的胚胎觀察無法進行識別和篩選[21-23]。本研究中為了提高工作效率、優化胚胎選擇流程，TLI組在胚胎選擇時采用形態學評分結合細胞期階段無直接卵裂模式的參考指標篩選囊胚。有文獻報道胚胎卵裂模式異常的原因可能是多倍體和遺傳紊亂，采用TLI動態指標聯合形態學評估篩選胚胎可以降低非整倍體風險，繼而提高胚胎著床潛能[24-25]。目前，胚胎發生直接卵裂的原因尚不清楚，有研究分析認為異常增多的中心粒可能引起紡錘體形成三極結構，造成卵裂球在有絲分裂過程中染色質異常分離而直接分裂成3細胞[22-23，25]。另外，直接卵裂細胞也可能存在染色體整合不完全、微核形成或多核的核缺陷[22]。本研究中TLI組在囊胚移植時采用形態學評分結合動態發育指標的方法選擇胚胎，結果獲得了明顯升高的妊娠率和著床率，這與Meseguer等[9]和Rubio等[26]研究報道的結果一致。

囊胚培養可以有效剔除卵裂期至囊胚期發育過程中潛能差或部分染色體異常的胚胎，并且囊胚期胚胎移植與子宮內膜同步性更佳，因此囊胚移植的妊娠結局更好，但囊胚著床的影響因素仍較多。為了降低研究偏倚，本研究均納入凍融囊胚移植的患者，且通過人工周期準備內膜減少了鮮胚周期卵巢刺激、血清激素水平[27]及內膜因素等的干擾。

綜上所述，目前并無確切證據表明采用TLI行囊胚培養的效果優于傳統培養系統，本研究中由于采用了序貫培養基而影響了TLI系統中囊胚發育環境的穩定性，今后可以嘗試換用一步法的單一培養基進行操作，以進一步證實TLI是否有利于囊胚的形成。本研究結果中TLI培養的囊胚移植妊娠結局更佳，可能與TLI系統聯合了傳統形態學與TLI動態指標對囊胚進行篩選有關。另一方面雖然TLI可以實時拍攝并存儲胚胎發育圖像，但由此產生的數據指標很多，且大部分軟件需要手動標記、分析動態指標，繁瑣的工作量限制了TLI動力學參數的廣泛運用，采用TLI行囊胚培養聯合人工智能分析圖像選擇胚胎將是我們將來的研究方向。