姜黃素對嬰兒血管瘤內皮細胞增殖、凋亡的影響及機制①

符垂師 云 川 馮業成 黃 天 (海南醫學院第一附屬醫院兒科，海口 570102)

嬰幼兒血管瘤(infantile hemangioma，IH) 是嬰幼兒最常見良性腫瘤，由中胚葉血管內皮細胞過度增殖所致[1]。IH通常發病于嬰幼兒出生或出生后 3～6 個月內，發病率約為3%～10%，發病機制尚未明確，目前治療手段主要為廣泛性冷凍、放射療法及口服類固醇類藥物等，多種新治療手段如干擾素、硬化劑、激光等也可用于IH治療，但副作用較大[2]。姜黃素是從姜黃中提取的酚類色素，具有多種藥理作用，其抗腫瘤作用不僅與抗腫瘤血管生成有關，還可誘導腫瘤細胞凋亡[3]。目前姜黃素用于嬰幼兒IH治療的作用及機制鮮有報道。本研究旨在探討姜黃素對HemECs增殖、凋亡的影響及機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑與儀器 姜黃素購自美國 Sigma公司;HIF-1α、VEGF抗體購自美國 Santa Cruz公司；Trio(A4902-1)購自美國 Invitrogen公司；兔抗人Ⅷ因子、CD31、CD34抗體購自武漢博士德公司；MCL-1、cl-Caspase-3和cl-PARP抗體及其二抗購于Santa Cruz 公司；Annexin Ⅴ/FITC凋亡檢測試劑盒購自美國 Qbiogene 公司；RT-qPCR試劑盒購自日本 TaKaRa公司；Trizol 購自Invitrogen公司；Real-time PCR儀購自美國ABI公司；CO2培養箱購自美國 Thermo Scientific公司；FASCalibur流式細胞儀購自美國BD公司；熒光顯微鏡購自德國Zeis公司；ELX800UV 酶標儀購自美國 Bio-Tek 公司。

1.1.2組織來源 1例IH組織標本來源于我院小兒外科，3個月齡，男性，家屬知情同意。

1.2方法

1.2.1細胞培養與鑒定 參照文獻[4]，取新鮮IH標本，剪成1～2 cm3組織塊，酶消化法分離培養HemECs。將消化后的組織塊剪碎至約1 mm3，接種于培養皿(1%明膠包被)，加入內皮細胞培養基(含10%胎牛血清的RPMI1640培養基)，37℃、5%CO2孵育。免疫熒光法鑒定 HemECs特異性表面標志物Ⅷ因子、CD31和CD34。

1.2.2CCK-8檢測HemECs增殖 將HemECs接種于96孔培養板(3 000個/孔)，孵育過夜，加入含不同濃度姜黃素(12.5、25、50、100 μmol/L)的培養液或DMSO(對照)培養液作用48 h，加入CCK-8試劑0.01 ml，孵育 4 h，取出后于酶標儀450 nm處測定各孔吸光度(A)。

1.2.3臺盼藍法染色 取各組細胞接種于96孔板，培養2 h后棄上清，PBS清洗，加0.4%臺盼藍溶液20 μl，靜置2 min，吸去染液，PBS清洗，顯微鏡下觀察并計數，臺盼藍染色呈藍色為死細胞。

1.2.4流式細胞儀檢測細胞凋亡 將HemECs接種于培養皿，加入含25 μmol/L姜黃素或DMSO(對照)培養48 h，收集細胞懸液，1 500 r/min離心5 min，Annexin V-FITC/PI試劑盒染色，流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.2.5電鏡觀察凋亡細胞 將HemECs接種于培養皿，加入25 μmol/L姜黃素或DMSO(對照)培養48 h，5 000 r/min離心20 min，棄上清，加入500 μl戊二醛固定，透射電鏡觀察。

1.2.6免疫熒光分析 參考文獻[5]，調整細胞懸液密度為2×104/ml，加入25 μmol/L姜黃素或DMSO(對照)作用24 h后，PBS清洗，4%多聚甲醛室溫固定，0.5% Tritonx-100室溫作用10 min；3%H2O2室溫作用20 min，羊血清室溫封閉30 min，加入一抗4℃孵育過夜，PBS清洗，加入熒光標記的二抗，37℃孵育1 h，滴加終濃度為5 mg/L加入DAPI，避光染色，封片，熒光顯微鏡下檢測拍照。

1.2.7RT-qPCR法檢測HIF-1α mRNA表達 將HemECs接種于培養皿，加入25 μmol/L姜黃素或DMSO(對照)培養24 h，收集細胞。按照Trizol試劑盒說明書操作，提取各組細胞總RNA，反轉錄為cDNA，SYBER Green法實時熒光定量PCR儀檢測。引物由上海生工公司合成，HIF-1α F：5′-GTCAGGAGACAACCACG-3′，R：5′-TGAATGGCCTGTGCA-GTG-3′；VEGF F：5′-TGTAAGGACGAAACGGGACT-3′，R：5′-AAAGCCAGCAGCAATTTCT-3′；GAPDH F：5′-CCAGGGCTTTTAACTC-3′，R：5′-GCTCCCCCGC-AAATGA-3′。2-ΔΔCt法計算。

1.2.8Western blot檢測MCL-1、cl-Caspase-3和cl-PARP蛋白表達 收集細胞，預冷 PBS 清洗，加入RIPA 裂解液提取總蛋白。 BCA 法測定總細胞提取液中蛋白濃度，取總蛋白25 μg上樣。經SDS-PAGE 分離，轉膜，置于 5% 脫脂奶粉中封閉2 h，加入一抗4℃孵育過夜，TBST 緩沖液洗滌，加HRP 標記二抗室溫孵育1 h，TBST緩沖液洗滌，ECL化學發光法顯色。

2 結果

2.1HemECs分離、鑒別 免疫熒光染色檢測顯示，細胞表面Ⅷ因子、CD31、CD34均顯強陽性，提示從IH組織中分離的細胞為HemECs，見圖1。

圖1 HemECs鑒別(×200)

2.2姜黃素對HemECs增殖的抑制作用 CCK-8結果顯示，48 h后不同濃度姜黃素均能抑制HemECs增殖，且姜黃素處理48 h后HemECs的IC50為31 μmol/L,臺盼藍法檢測結果顯示，姜黃素治療48 h后HemECs死亡呈劑量依賴性，見圖2。

圖2 姜黃素對HemECs增殖的抑制作用(×400)

2.3流式細胞儀檢測HemECs凋亡及電鏡觀察結果 流式細胞儀檢測結果顯示，對照組和姜黃素組HemECs凋亡率分別為(3.9±0.2)%、(33.6±3.6)%，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖3；透射電鏡觀察結果顯示，對照組IH內皮細胞胞膜完整、胞漿均一，具有相對正常的內質網及線粒體結構。姜黃素組腫瘤細胞出現凋亡形態學特征，細胞膜形態基本完整，但核內染色質濃縮、細胞核形態不規則，發生碎裂，同時細胞內可見凋亡小體形成，見圖4。

圖3 流式細胞儀檢測HemECs凋亡

圖4 電鏡觀察HemECs結構變化(×700)

2.4姜黃素對HemECs中HIF-1α和VEGF表達的影響 免疫熒光結果顯示，與對照組相比，48 h后姜黃素下調HIF-1α 和VEGF蛋白表達，見圖5；RT-qPCR結果顯示，姜黃素可明顯抑制HemECs中HIF-1α mRNA及VEGF mRNA表達(P<0.05)，見圖6。

2.5HemECs中MCL-1、cl-Caspase-3和cl-PARP蛋白表達 Western blot結果可知，姜黃素組MCL-1蛋白表達水平明顯低于對照組(P<0.05)，而cl-Caspase-3 和cl-PARP蛋白表達明顯高于對照組(P<0.05)，見圖7。

圖7 Western blot檢測HemECs MCL-1、cl-Caspase-3和cl-PARP蛋白表達

3 討論

姜黃屬姜科植物，主要生長于熱帶和亞熱帶地區。姜黃素為姜黃的主要活性成分，具有消腫止痛、行氣活血、通經止痛等作用。研究表明，姜黃素具有抗微生物、清除自由基、抗炎、抗氧化、抗癌、抗肝纖維化、抗動脈粥樣硬化等藥理作用[6]。姜黃素可通過不同途徑誘導腫瘤細胞凋亡，且對正常細胞無影響。美國國立腫瘤研究所已將姜黃素作為抗突變劑和抗癌劑列為第3代抗癌化學藥，其抗腫瘤作用可通過多種信號傳導途徑實現，如細胞凋亡、免疫調節、細胞增殖、血管生成、浸潤和轉移等[7]。

缺氧誘導因子 HIF-1(hypoxia inducible factor-1，HIF-1)是最重要的低氧轉錄調節因子，在缺氧的肝癌細胞核提取物中發現[8]。 HIF-1α 是HIF-1的亞基，是唯一的氧調節單位，決定HIF-1活性，可促進腫瘤增殖、新生血管形成及維持腫瘤細胞的量代謝；VEGF是具有內皮細胞特異性的有絲分裂原，通過特異性受體VEGFR介導其生物學效應，誘導血管及淋巴內皮細胞增殖，促進多種腫瘤血管形成和腫瘤生長[9]。本研究發現，48 h后不同濃度姜黃素均可抑制HemECs增殖，且呈劑量依賴性。免疫熒光結果顯示，48 h后姜黃素下調HIF-1α 和VEGF蛋白表達，RT-qPCR結果顯示，姜黃素能明顯抑制HemECs中HIF-1α mRNA表達，提示姜黃素可抑制HemECs中HIF-1α蛋白表達，從而下調VEGF蛋白表達，上調其抗增殖活性，與既往研究結論一致[10]。HIF-1α可在正常和腫瘤細胞中調節MCL-1轉錄，表明抑制HIF-1α也可抑制MCL-1表達[11]。

流式細胞儀檢測結果顯示，對照組和姜黃素組HemECs凋亡率差異具有統計學意義，透射電鏡觀察結果顯示姜黃素處理后HemECs超微結構具有凋亡形態學特征。同時，Western blot檢測姜黃素組HemECs中cl-Caspase-3蛋白表達明顯升高，提示姜黃素可誘導HemECs凋亡。

細胞凋亡是指細胞在一定生理或病理條件下出現的正常的選擇性死亡，由于其被細胞內部某些特定基因所操縱，故稱程序性死亡。過度凋亡可能會引發神經退行性疾病、中風、心臟衰竭等,而抑制凋亡則與腫瘤等疾病發生有關。髓細胞白血病基因-1(myeloid cell leukemin-1，MCL-1)是Bcl-2家族基因中抗細胞凋亡成分，MCL-1基因在人多種腫瘤細胞中高表達，且和腫瘤耐藥性關系密切。研究顯示，MCL-1作用于 Caspase-3 上游，其裂解產物可促進細胞凋亡，Bcl-2 家族蛋白激活可誘導線粒體膜透化，調節Cyt-C在線粒體中的釋放進而激活Caspase-9前體，最終引起Caspase-3剪切活化，導致細胞凋亡[12,13]。Caspase-3 在細胞凋亡中扮演死亡執行者角色，參與多種重要細胞成分切割，如DNA依賴的蛋白激酶(DNA-PK)、聚ADP核糖聚合酶(PARP)等，從而促進細胞凋亡[14]。PARP廣泛存在于真核細胞核內，是細胞活力的穩定器和DNA損傷的感受器，可識別結構損傷DNA片段而被激活，進而修復損傷的DNA。c-PARP是細胞凋亡的特征性標志物，其無法識別損傷DNA，但具有DNA修復的聚合酶活性，聚集于細胞質[15]。本研究Western blot檢測結果顯示，姜黃素組MCL-1蛋白表達明顯低于對照組，而cl-Caspase3 和cl-PARP蛋白表達水平明顯高于對照組，表明姜黃素可能通過下調HemECs中MCL-1表達，從而上調下游因子Caspase-3及cl-PARP表達，促進細胞凋亡。

綜上所述，本研究顯示姜黃素可在體外劑量依賴性抑制HemECs增殖、凋亡，其機制可能為抑制MCL-1和HIF-1α表達，從而上調cl-Caspase-3 和cl-PARP表達，但具體機制有待進一步研究。