右美托咪定對糖尿病小鼠腎缺血再灌注損傷的保護作用①

杜 剛 陳 娜 劉曉艷 趙 亮 (山東省淄博市第一醫院手術麻醉科,淄博 255200)

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一種代謝紊亂性疾病，伴有多種并發癥，包括微血管和大血管病變及缺血再灌注性(ischemia/reperfusion，IR)損傷等[1]。IR是造成急性腎損傷的高危因素，可造成腎組織細胞損害，如腎小管內皮細胞凋亡和壞死[2，3]。內質網(endoplasmic reticulum，ER)是具有多種生物學功能的細胞器，包括對細胞各種壓力的響應，如低氧、饑餓、感染和分泌需要的變化[4]。ER應激是對IR損傷的應激反應，IR損傷會產生大量活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)，并造成蛋白質折疊和組裝紊亂，這些未折疊或錯誤折疊的蛋白質積聚后會造成ER應激[5]。右美托咪定(dexmedetomi-dine，DEX)是一種具有高度特異性和α2腎上腺素能的高效抑制劑，具有鎮靜、止痛和交感神經阻滯的效用[6]。在腎組織中，α2腎上腺素能受體廣泛分布于腎小管的近端、遠端及其他脈管周圍[7]。研究顯示，DEX可以在IR性腎損傷中有效減少腎小管上皮細胞凋亡，并促進腎小管結構重建[6-8]。有動物實驗表明，DEX可以有效保護IR損傷后的多種器官損傷，包括腎臟、心臟、大腦等，其主要通過抗凋亡、抗炎和抗氧化應激等發揮保護功能[9-11]。本文根據既往研究成果，探究DEX在糖尿病小鼠腎IR損傷中的治療效果及ER應激和細胞凋亡相關機制，以期為糖尿病腎病的診治提供參考。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑 血清尿氮素含量測定試劑盒(貨號：BC1535)購自北京索萊寶科技有限公司；血清肌酐酸測定試劑盒(貨號：GMS70021.1)購自上海杰美基因醫藥科技有限公司；尿蛋白含量檢測試劑盒(貨號：GB370S)購自北京九強生物技術股份有限公司；小鼠LDL檢測試劑盒(貨號：QY-M30023)、小鼠SOD檢測試劑盒(貨號：QYS-03061)和小鼠MDA檢測試劑盒(貨號：QYS-03052)購自上海齊一生物科技有限公司；Click-iT?Plus TUNEL assay試劑盒(貨號：C10618)購自Invitrogen公司；蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒(貨號：C0105)購自碧云天；CHOP(貨號：ab11419)、ATF6(貨號：ab37149)、Cleaved Caspase-12(貨號：ab62484)、GAPDH(貨號：1056)一抗購自美國Abcam公司；HRP標記的山羊抗小鼠二抗購自美國Santa Cruz公司。

1.1.2儀器 半干轉膜儀、電泳儀均購于美國伯樂公司；Multiskan GO酶標儀購自Thermo；Gel View 6000化學發光凝膠成像儀購于廣州云星儀器有限公司；分析天平ME204購自梅特勒托利多國際貿易(上海)有限公司；DW-86L578J -86℃超低溫冰箱、DW-25L262h 25℃低溫保存箱和HYC-3102～8℃醫用冷藏箱購自海爾公司；Eppendorf 5702R臺式冷凍離心機購自德國艾本德股份公司。

1.1.3實驗動物 50只8周齡糖尿病db/db小鼠購自北京維通利華實驗動物公司，許可證號為SYXK (京) 2014-0001，合格證號：0015675。

1.2方法

1.2.1糖尿病小鼠腎IR模型建立 50只糖尿病db/db小鼠適應性飼養一周后隨機平均分為假手術組(Sham組)、IR手術組(IR組)及IR手術+DEX組(DEX劑量分別為12.5、25、50 μg/kg)。IR+DEX組小鼠在手術前30 min分別腹腔注射12.5、25、50 μg/kg 的DEX。IR組小鼠經非創傷性血管鉗封閉雙腎蒂，缺血45 min后解除封閉。Sham組小鼠經相同解剖過程，但不進行腎蒂封閉。手術結束后，青霉素溶液(20萬 U/ml)沖洗手術切口，縫合皮膚，并肌注青霉素鈉4萬U/只以防術后感染。

1.2.2小鼠基本指標檢測 各組處理結束后，提取小鼠血清及腎組織標本，檢測血清中血清尿氮素(blood urea nitrogen，BUN)、尿蛋白和血清肌酐酸表達；組織經處理后檢測相應LDH、SOD和MDA表達水平(詳見下述)。

1.2.3HE染色檢測糖尿病小鼠腎組織形態 切片經3次二甲苯濃度脫蠟，梯度濃度酒精脫苯后，蒸餾水沖洗5 min×2次；蘇木素染核15 min，蒸餾水沖洗；0.5%鹽酸酒精分色，蒸餾水沖洗15 min；70%和80%酒精先后浸泡10 min，伊紅復染1 min，90%酒精分化10 s；95%酒精脫水2次，各10 min，100%酒精脫水2次，各15 min，二甲苯透明3次，每次時間分別為10 min、15 min、15 min；中性樹脂封片觀察。

1.2.4TUNEL染色鑒定糖尿病小鼠腎組織細胞凋亡 小鼠處死后腎組織經石蠟包埋，二甲苯中脫蠟5～10 min，換用新鮮二甲苯，再次脫蠟5～10 min；經無水乙醇5 min，經90%乙醇2 min，70%乙醇2 min脫苯，蒸餾水2 min。滴加20 μg/ml不含DNase的蛋白酶K，P0106洗滌液20～37℃下作用15～30 min。PBS洗滌3次。配制適當量TUNEL檢測液滴加至樣品，37℃避光孵育60 min。洗滌后用抗熒光猝滅封片液封片后顯微鏡下(激發波長范圍為450～500 nm)觀察。

1.2.5ELISA檢測腎組織細胞炎癥因子 ELISA法檢測糖尿病小鼠腎組織中相關ER應激分子乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和丙二醛(malondialdehyde，MDA)等水平。小鼠腎組織從-86℃超低溫冰箱中取出后，冰上溶解，稱取0.03 g組織，剪碎研磨，加入1 ml PBS緩沖液，4 000 r/min(離心半徑=13.5 cm)低溫離心8 min，取上清液用于實驗。分別設空白孔，標準品孔，待測樣品孔，標準品孔加入標準品50 μl，樣品孔先加入樣品稀釋液40 μl后加待測樣品10 μl。封板后37℃孵育30 min。洗滌母液經蒸餾水稀釋30后備用。緩慢揭掉封板膜，棄去液體后，每孔加洗滌液清洗30 s，重復5次，拍干酶標板。每孔加酶標試劑50 μl，空白孔不加。再次封板后37℃孵育30 min。重復上述洗滌步驟，各孔加入顯色劑A液和B液各50 μl，緩慢振蕩混勻后，37℃避光顯色10 min。各孔加入50 μl 終止液終止反應(終止后藍色立即轉為黃色)。檢測450 nm波長下OD值(測定應在加入終止液后的15 min內進行)。

1.2.6Western blot檢測細胞中蛋白表達 檢測組織中ER應激及凋亡相關因子CHOP、ATF6和Cleaved Caspase-12表達水平。收集細胞，PBS清洗3次，用添加蛋白酶抑制劑的細胞裂解液進行裂解，RIPA裂解液提取各組細胞總蛋白。BCA試劑盒檢測總蛋白濃度，10% SDS-PAGE分離蛋白后用半干轉膜儀轉移蛋白質至PVDF膜。5%脫脂牛奶室溫封閉蛋白2 h后加入一抗，4℃封閉過夜，第2天加入對應二抗室溫封閉1 h，最后滴加ECL曝光顯影，顯色并統計灰度值計算相對表達量。

2 結果

2.1DEX改善糖尿病小鼠腎功能異常指標 與Sham組小鼠相比，IR組小鼠BUN、尿蛋白和血清肌酐酸均顯著上調(P<0.01)。經DEX治療后，與IR組小鼠相比IR+DEX各劑量組小鼠BUN、尿蛋白和血清肌苷酸均下降(P<0.05或P<0.01)(圖1)。

圖1 各組糖尿病小鼠腎功能指標檢測

2.2DEX改善糖尿病小鼠體內ER應激相關分子水平 ELISA結果顯示，與Sham組相比，IR組ER應激產物LDH和MDA表達升高(P<0.01，圖2A、C)；SOD表達降低(P<0.01，圖2B)；與IR組相比，IR+DEX各劑量組ER應激產物LDH和MDA表達降低(P<0.05或P<0.01，圖2A、C)，而SOD表達升高(P<0.05或P<0.01，圖2B)。

圖2 ELISA檢測糖尿病小鼠腎組織ER應激相關分子水平

2.3DEX改善糖尿病小鼠腎組織細胞形態 HE染色結果顯示，與Sham組相比，IR組糖尿病小鼠腎組織細胞結構不清晰，腎小管擴張，細胞變扁，細胞核濃縮，腎小管中有脫落細胞，同時伴有炎癥細胞浸潤及充血現象；經DEX治療后，與IR組相比，IR+DEX各劑量組小鼠腎組織細胞輪廓逐漸清晰，腎小管緊實，細胞核恢復正常，炎癥浸潤和充血現象得到改善(圖3)。

圖3 HE染色檢測糖尿病小鼠腎組織細胞形態

2.4DEX改善糖尿病小鼠腎組織細胞凋亡程度 TUNEL染色結果表明，與Sham組相比，IR組小鼠腎小管細胞發生明顯凋亡(P<0.01)；經DEX處理后的各IR+DEX劑量組小鼠腎小管細胞凋亡現象均得到改善(P<0.05或P<0.01，圖4)。

圖4 TUNEL染色鑒定糖尿病小鼠腎組織細胞凋亡

2.5DEX改善糖尿病小鼠腎組織ER應激及凋亡相關因子水平 Western blot結果顯示,與Sham組相比，IR組三者表達均上調(P<0.01)；與IR組相比，各IR+DEX劑量組CHOP和Cleaved Caspase-12表達下調(P<0.05或P<0.01)，IR+DEX低劑量組ATF6表達差異無統計學意義，IR+DEX中、高劑量組ATF6表達水平降低(P<0.05或P<0.01,圖5)。

圖5 Western blot檢測各組ER應激和凋亡相關蛋白表達

3 討論

糖尿病是常見的疾病類型，全球大約有2.85億患者正在遭受糖尿病折磨，且這一數據將在2030年增至4.3億人[12]。糖尿病患者同時會伴有多種并發癥，包括微血管和大血管病變及IR損傷等，導致腎損傷和腎功能紊亂[1]。因此針對腎IR損傷相關機制的研究具有重要意義。

腎IR損傷相關的ER應激和細胞凋亡機制尚未闡明。ER功能失調和應激反應不但是Ⅰ型和Ⅱ型糖尿病的主要發病機制，也是其他自體免疫性疾病和神經退化性疾病的基礎[13]。大量研究表明，在糖尿病進程中，ER系統內平衡性改變可直接導致胰島β細胞功能紊亂甚至細胞死亡[14]。本研究建立db/db小鼠糖尿病模型，以雙側腎IR模型為研究體系，發現IR模型組小鼠腎組織細胞發生嚴重的ER應激反應，腎組織細胞內LDH和MDA表達上調，SOD表達下調。

深入研究糖尿病腎IR損傷發病機制對控制糖尿病急性腎損傷具有重要意義。目前有幾種常用方法來治療IR，藥物護理是降低IR損傷風險最常用的手段，如DEX、硫酸鎂及胰島素等[15-17]。本研究探究了DEX對糖尿病小鼠腎IR損傷的保護作用，根據HE染色和免疫組化結果確定DEX可避免由IR導致的腎組織細胞的損傷和凋亡；并且檢測到BUN、尿蛋白和血清肌酐酸明顯下調。

腎IR損傷是在缺血環境和再次灌注過程中產生的復雜炎癥反應過程，伴隨一系列細胞炎癥活動事件，如炎癥細胞浸潤增加微血管通透性、組織水腫、腎髓質細胞功能紊亂及腎間質及腎小管形變等癥狀[18-20]。既往研究表明，DEX預處理對腎臟IR損傷具有保護作用，且是以α2腎上腺素受體依賴性方式發揮作用，并通過PI3K/AKT信號通路活化來發揮抗凋亡活性[21]。本研究表明DEX治療可改善小鼠受損的腎組織。在抗ER應激方面，IL-4、IL-10等可上調SOD，下調MDA和LDH表達[22，23]，本研究結果證實DEX處理后小鼠腎組織中SOD顯著上調，LDH和MDA顯著下調，ER應激水平降低。Western blot檢測DEX處理后小鼠腎組織ER應激相關蛋白表達水平，發現CHOP和ATF6表達降低，說明DEX可以有效降低小鼠ER應激反應。

腎IR損傷不僅伴有嚴重的ER應激反應，同時還會造成腎小管內皮細胞凋亡和急性腎小管細胞壞死等[18-20]。本研究利用TUNEL染色檢測各處理組腎組織細胞后發現，IR組小鼠細胞嚴重凋亡；經DEX治療后，細胞凋亡現象得到明顯緩解。進一步考察凋亡相關蛋白表達情況后發現，Cleaved Caspase-12在IR組中顯著上調，在接受DEX治療后則恢復至接近Sham組小鼠水平。Su等[24]報道稱，內質網應激凋亡途徑是重要的內源性凋亡途徑之一，Caspase-12是定位于內質網外膜上的促凋亡分子，是該途徑的重要凋亡蛋白。表明在糖尿病小鼠IR損傷中，DEX可有效抑制細胞凋亡。

綜上所述，DEX對糖尿病小鼠腎IR損傷具有一定治療效果，其發揮作用的機制可能通過DEX抑制腎組織細胞中ER應激和凋亡相關通路實現。但ER應激反應涉及諸多通路，如Ire1通路、Perk通路及ATF6通路等[5]；IR損傷的機制具體涉及哪幾種通路還需要進一步明確。