利用表面增強拉曼光譜(SERS)技術快速檢測水與尿液中舒芬太尼的研究

陳志杰，馬小衛，陳薪璇，韓斯琴高娃2,*，哈斯烏力吉

(1.二四二醫院 眼科，黑龍江 哈爾濱 150066；2.內蒙古民族大學附屬醫院，內蒙古 通遼 028007；3.哈爾濱工業大學 可調諧(氣體)激光技術國家級重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150080)

舒芬太尼(C22H30N2O2SC6H8O7)屬于阿片類藥物，是目前臨床手術中最常用的麻醉藥品[1]，其鎮痛活性是芬太尼的9.3倍，嗎啡的2 304倍。但舒芬太尼會導致典型的阿片類藥物癥狀，過量使用會引起如呼吸抑制、心搏停止等副作用，并且會使患者產生藥物依賴，甚至引發死亡[2]。2019年4月1日，公安部、國家衛生健康委員會、國家藥品監督管理局聯合發布了《關于將芬太尼類物質列入非藥用類麻醉藥品和精神藥品管制品種增補目錄的公告》。因此快速、準確地檢測芬太尼類藥物，對管制藥品的監督和管理具有重要意義。

目前對舒芬太尼的檢測方法主要有高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜-質譜聯用法(GC-MS)、液相色譜-質譜聯用法(LC-MS)[3-5]等。雖然這些方法都具有很高的靈敏度，但是樣品預處理步驟繁瑣，儀器設備體積較大、價格昂貴，不利于現場快速檢測。因此建立一種快速、高效、簡便的鑒定方法具有一定的意義。

隨著納米技術的發展，以金或銀等貴金屬納米顆粒作為基底的表面增強拉曼散射(SERS)技術將檢測靈敏度提高了數百萬倍，很好地克服了傳統拉曼光譜信號微弱的缺陷，被廣泛應用于藥物分析[6-8]和食品安全[9-11]等領域。目前，雖然已有采用SERS對舒芬太尼進行定性分析[12]及對血漿中舒芬太尼進行檢測的報道[13]，但未見采用該技術對水和尿液中的舒芬太尼進行檢測的研究。由于吸毒者一般將舒芬太尼稀釋后使用，且通過吸毒者的尿液可檢測該類藥物，因此對水和尿液中舒芬太尼的檢測具有一定意義。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

使用BWS415-785H型便攜式拉曼光譜儀采集拉曼光譜，其激發光源為785 nm，光譜測量范圍為68～2 700 cm-1，光譜分辨率小于3 cm-1，激光功率為80 mW，積分時間為5 s。使用日本日立公司的SU8010掃描電子顯微鏡獲得銀溶膠的掃描電鏡圖(SEM)。

硝酸銀(AgNO3)、檸檬酸鈉(C6H5Na3O7)(國藥集團化學試劑有限公司)；抗壞血酸(C6H8O6，阿法埃莎(中國)化學有限公司)；枸櫞酸舒芬太尼注射液(1 mL/50 μg/支，宜昌人福藥業公司)。人工尿液(創峰自動化科技有限公司)。

1.2 樣品的制備

舒芬太尼水溶液的制備：先用枸櫞酸舒芬太尼注射液配制質量濃度為10 μg/mL的標準水溶液，然后用去離子水稀釋成2、1、0.5、0.1、0.05、0.01 μg/mL梯度質量濃度的舒芬太尼水溶液。

舒芬太尼尿液樣品的制備：參照Han等[14]的方法對尿液進行前處理，具體步驟如下：將一定濃度的枸櫞酸舒芬太尼水溶液與人工尿液按體積比1∶9進行混合，得到質量濃度分別為2、1、0.5、0.25、0.1 μg/mL的尿液樣品。取80 μL該樣品添加到1.5 mL的EP管中，加入同體積10 g/L的NaOH溶液將pH值調至11.0。隨后加入固體NaCl，使溶液充分飽和，最后加入80 μL環己烷萃取。充分混合后靜置1 min，取上層清液作為待測樣品。

1.3 銀溶膠的制備

參考Qin等[15]的方法制備銀溶膠，制備步驟為：首先配制250 mL含6.0×10-4mol/L抗壞血酸和3.0×10-3mol/L檸檬酸鈉水溶液，將混合溶液緩慢攪拌，水浴加熱至30 ℃，快速加入2.5 mL 0.1 mol/L AgNO3，并在900 r/min轉速下反應15 min。然后加熱至100 ℃并煮沸2 h。將制備好的銀溶膠冷卻至室溫，于4 ℃下避光儲存。

2 結果與討論

2.1 銀溶膠的表征

圖1A為銀溶膠的SEM圖，可以看出，銀溶膠形狀近似球形，且分散性良好，平均直徑約56 nm，其粒徑分布圖見圖1B。

2.2 舒芬太尼拉曼特征峰的歸屬

利用Gaussian 09W軟件包含的DFT理論[16]，使用混合密度泛函B3LYP方法對舒芬太尼的分子結構進行優化，并計算理論拉曼光譜。同時，測定了6 μg/mL舒芬太尼水溶液的SERS光譜，結果如圖2所示。可以看出，與理論計算相比，實際測得的特征峰位置發生了微小的頻移，但基本可以一一對應。這是由于實驗過程中舒芬太尼分子在銀溶膠表面發生了化學吸附[17]所致。舒芬太尼的特征峰峰位歸屬見表1。

表1 舒芬太尼理論和實驗振動頻率Table 1 Theoretical and experimental vibration frequencies of sufentanil

2.3 SERS增強因子的計算

為了確定銀溶膠的增強效果，測量了6 μg/mL舒芬太尼水溶液的SERS光譜和50 μg/mL舒芬太尼水溶液的常規拉曼光譜，結果見圖3A，并根據公式(1)計算增強因子AEF[18]：

(1)

式中，ISERS和Inormal分別為SERS光譜與常規拉曼光譜的特征峰強度，CSERS和Cnormal分別為SERS光譜與常規拉曼光譜檢測時的樣品濃度。

根據式(1)得出增強因子為1.215×103，表明銀溶膠對舒芬太尼有很好的放大作用，可對低濃度的舒芬太尼進行檢測。另外，為了排除銀溶膠自身拉曼信號對樣品特征峰的影響，對銀溶膠的拉曼信號進行了檢測。從圖3B可看出，銀溶膠本身無明顯拉曼信號，不會影響樣品的檢測。

2.4 促凝劑的選取

相關研究顯示，鹵素離子可提高銀溶膠的增強效果。這是因為，向銀溶膠中加入鹵素離子時，由于鹵素離子在銀納米顆粒表面的吸附能力大于檸檬酸根，且可與Ag形成化學鍵，因此將置換掉銀納米顆粒表面的檸檬酸根，從而破壞溶膠體系的電勢平衡，使得溶膠顆粒聚集，金屬溶膠的增強效果得以顯著改善[19-22]。

本文選取NaBr、NaCl和KI 3種無機鹽的水溶液作為促凝劑進行對比研究，結果如圖4A所示。從圖可看出，加入促凝劑之后，銀溶膠的增強作用有了明顯提高。在相同濃度(1 mol/L)下，上述3種促凝劑中NaBr溶液的增強效果最好，這可能是由I-、Cl-和Br-3種離子的吸附特性不同導致的。適量的無機鹽可起到良好的增強作用，但過量則會導致銀溶膠顆粒過度聚集，對增強效果不利[12]。如圖4B所示，當NaBr溶液的質量濃度分別為0.051 5、0.103 0、0.154 5、0.206 0 g/mL時，位于1 004 cm-1處特征峰的相對強度分別為2 097.98、2 247.97、4 031.07、2 606.18 a.u.，即0.154 5 g/mL NaBr溶液的增強效果最好。

另外，本文還對比研究了樣品、銀溶膠和促凝劑的體積混合比對SERS增強效果的影響。結果顯示，當樣品、銀溶膠和促凝劑的體積混合比為3∶5∶2時，SERS增強效果最好。

因此本實驗中選用0.154 5 g/mL的NaBr水溶液作為促凝劑，且每次檢測時樣品、銀溶膠和促凝劑的體積比均為3∶5∶2(當舒芬太尼水溶液的質量濃度分別為0.01、0.1、0.5、1、2 μg/mL時，樣品、銀溶膠和促凝劑物質的量之比分別約為1∶63∶38 659、1∶6.3∶3 866、1∶1.26∶773、1∶0.63∶386和1∶0.315∶193)。使3種液體充分混合后進行SERS檢測。

2.5 重復性測定

為了研究方法的重復性，在相同實驗條件下對舒芬太尼水溶液進行15次重復測定，結果如圖5所示，計算得到舒芬太尼水溶液位于1 004、1 080 cm-1處拉曼特征峰強度的相對標準偏差(RSD)分別為2.5%和2.7%，表明利用SERS技術檢測舒芬太尼具有很好的重復性。

圖6 不同質量濃度舒芬太尼水溶液的SERS光譜圖Fig.6 SERS spectra of sufentanil in aqueous solution with dirrerent mass concentrations

表2 舒芬太尼水溶液的回收率及相對標準偏差Table 2 Recoveries and RSDs of sufentanil in aqueous solution

2.6 水溶液中舒芬太尼的檢測

不同質量濃度舒芬太尼水溶液的SERS光譜圖如圖6所示，空白對照組為去離子水。根據圖6，對位于1 004 cm-1處的特征峰強度隨舒芬太尼水溶液質量濃度的變化進行線性擬合，發現舒芬太尼質量濃度(x)在0.01～0.5 μg/mL范圍內與其特征峰強度(y)呈線性關系，線性方程為y=2 446.29x+179.28，相關系數為r2=0.979。此外，根據檢出限(LOD)的定義(特征峰強度等于3倍信噪比時的樣品濃度)[23]，計算得到LOD為0.09 μg/mL。

為了驗證該方法的可靠性，配制質量濃度分別為0.075、0.30、0.60 μg/mL的舒芬太尼加標水溶液樣品，并根據線性方程計算出回收率及RSD(n=3)，結果見表2。其回收率為96.3%～107%，RSD為4.2%～4.7%。

2.7 人工尿液中舒芬太尼的檢測

不同質量濃度芬太尼尿液的SERS光譜圖如圖7所示，空白對照組為尿液。根據圖7，對位于1 004 cm-1處特征峰的強度(y)隨舒芬太尼尿液質量濃度(x)的變化進行線性擬合，結果顯示，舒芬太尼尿液質量濃度(x)在0.25～6 μg/mL范圍之內與特征峰強度(y)呈線性關系，線性方程為y=80.07x+176.51，相關系數為r2=0.968，計算得LOD(3倍信噪比)約為1.55 μg/mL。

圖7 不同質量濃度舒芬太尼尿液的SERS光譜圖Fig.7 SERS spectra of sufentanil with different mass concentrations in urine

表3 舒芬太尼人工尿液的回收率及相對標準偏差Table 3 Recoveries and RSDs of sufentanil in artificial urine

由于所檢測水溶液和尿液樣品的質量濃度范圍不同，使得兩個擬合曲線的斜率差異較大。這是因為當樣品質量濃度較低時，特征峰強度隨樣品質量濃度的增加而迅速上升；而當樣品質量濃度較高時，出現飽和現象，導致特征峰強度隨樣品質量濃度的增加緩慢上升或降低[24]。

同樣，為了驗證該方法的可靠性，配制質量濃度分別為0.75、3、10 μg/mL的舒芬太尼加標人工尿液樣品，并根據線性擬合曲線計算回收率及相對標準誤差，結果如表3所示。實際樣品的回收率為95.8%～106%，RSD(n=3)為3.3%～5.2%。

3 結 論

本文基于SERS技術對水溶液和尿液中的舒芬太尼進行研究。通過密度泛函理論對舒芬太尼的拉曼光譜進行了計算，并與實驗值對比，進而對特征峰進行了歸屬。然后以銀溶膠作為活性基底，NaBr水溶液為促凝劑，對舒芬太尼的水溶液和尿液進行SERS檢測。在水溶液和尿液中，舒芬太尼的檢出限分別為0.09、1.55 μg/mL。該方法具有快速、準確、無損、操作簡便等優點，為水和尿液中舒芬太尼的快速檢測打下了良好的基礎。