超高效液相色譜法測定藥用復合膜中7種水溶性熒光增白劑

左軍鳳，賀針華，2，熊馬劍，朱碧君*

(1.江西省藥品檢驗檢測研究院，江西省藥品與醫療器械質量工程技術研究中心，國家藥品監督管理局中成藥質量評價重點實驗室，江西 南昌 330029；2.江西中醫藥大學，江西 南昌 330004)

熒光增白劑的檢測方法主要有紫外燈照射觀測法[9-10]、熒光分光光度法[11-12]、液相色譜法[13-14]、液相色譜-串聯質譜法[15]。紫外燈照射觀測法只能定性分析熒光增白劑，不能確定其種類和含量。液相色譜法和液相色譜-串聯質譜法均可用于熒光增白劑的定性和定量檢測[16]。其中，液相色譜-串聯質譜法雖定性準確、靈敏度高，但設備價格昂貴，維護和使用成本很高[17]。與傳統的高效液相色譜法相比，超高效液相色譜法擁有更快的分析速度、更高的靈敏度和更好的分離度，可縮短分析時間，節約溶劑，降低分析成本。為了研究藥用復合膜中水溶性熒光增白劑，本文采用超高效液相色譜法建立了上述7種水溶性熒光增白劑的檢測方法。方法簡便、快速，適用于藥用復合膜樣品中水溶性熒光增白劑的分析。

1 實驗部分

1.1 儀器與試藥

LC-30AD 超快速液相色譜儀，配PDA檢測器(日本島津公司)；MS-105電子天平(梅特勒-托利多控股有限公司)；KQ-500DE超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

熒光增白劑均購自深圳市瑞吉特生物科技有限公司，7種水溶性熒光增白劑試劑分別為：5-{4，4，-雙[[4-[雙(2-羥基乙基)氨基]-6-(4-磺酸鈉苯胺)-1，3，5-三嗪-2-基]氨基]苯乙烯-2，2，-二磺酸鈉}(FWA220，批號：180106)、2，2，-(1，2-乙二基)雙[5-[[4-[雙(2-羥乙基)氨基]-6-[(3-二氧苯基)氨基]-1，3，5-三嗪-2-基]氨基]苯磺酸鈉](FWA24，批號：181204)、4，4，-雙(4，4，-羥乙基氨基-6-苯胺基-1，3，5-三嗪-2-氨基)二苯乙烯-2，2，-二磺酸鈉(FWA113，批號：190320)、2，2，-[1，2-乙二基雙[(3-磺基-1，4-亞苯基)亞氨基[6-[雙(2-羥乙基)氨基]-1，3，5-三嗪-4，2-二基]亞氨基]]雙(1，4-苯二磺酸)六鈉鹽(FWA264，批號：190204)、4，4，-雙[(4-苯胺基-6-甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基)氨基]二苯乙烯-2，2，二磺酸二鈉(FWA134，批號：181125)、2，2，-(1，2-乙二基)雙[5-[[4-(二乙氨基)-6-[(2，5-二磺苯基)氨基]-1，3，5-三嗪-2-基]氨基]苯磺酸]六鈉鹽(FWA357，批號：190215)、4，4，-雙[(4-苯胺基-6-嗎啉基-1，3，5-三嗪-2-基)氨基]二苯乙烯-2，2，-二磺酸二鈉鹽(FWA71，批號：181112)。甲醇、乙腈(色譜純，西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司)。其余試劑均為分析純，實驗用水為超純水。

聚酯/鋁/聚乙烯藥用復合膜(PET/Al/PE)、聚酯/鋁/聚丙烯藥用復合膜(PET/Al/PP)、紙/鋁/聚乙烯藥用復合膜(紙/Al/PE)、玻璃紙/鋁/聚乙烯藥用復合膜(PT/Al/PE)、鋁/聚乙烯藥用復合膜(Al/PE)、聚丙烯/鋁/聚乙烯藥用復合膜(PP/Al/PE)、聚酯/鍍鋁聚酯/聚乙烯藥用復合膜(PET/VMPET/PE)、雙向拉伸聚丙烯/真空鍍鋁流延聚丙烯藥用復合膜(BOPP/VMCPP)、聚酯/聚乙烯藥用復合膜(PET/PE)9個品種共191批藥用復合膜樣品以及33批聚酯原料膜、28批聚乙烯原料膜、7批聚丙烯原料膜、5批紙原料樣品，來源于國內110個生產廠家。

1.2 標準溶液的配制

稱取FWA220、FWA264、FWA357各0.08 g(精確至0.1 mg)，FWA24、FWA113、FWA134、FWA71各0.02 g(精確至0.1 mg)，分別置于50 mL棕色容量瓶中，加入40%乙腈水溶液(pH 11.0)溶解并稀釋至刻度，搖勻，得質量濃度分別為1 600 μg/mL和400 μg/mL的單標母液。分別精密移取單標母液各10 mL于100 mL棕色容量瓶中，加40%乙腈水溶液稀釋至刻度，搖勻，得質量濃度分別為160 μg/mL和40 μg/mL的混合標準儲備液，用40%乙腈水逐級稀釋并定容，配制系列標準使用液，其中FWA220、FWA264、FWA357的質量濃度梯度分別為160、80、40、10、8、4 μg/mL，FWA24、FWA113、FWA134、FWA71的質量濃度梯度分別為40、20、10、2.5、2、1 μg/mL,于冰箱中保存。

1.3 樣品預處理

取藥用復合膜樣品，剪成約0.5 cm×0.5 cm的碎片，混勻后取約1 g，精密稱定，置于50 mL具塞錐形瓶中，精密加入10 mL 40%乙腈水溶液(三乙胺調至pH 11.0)，50 ℃超聲水浴35 min后，用0.22 μm 微孔濾膜濾過，即得。

1.4 色譜條件

Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流動相A為乙腈-甲醇混合溶液(2∶3，體積比)，流動相B為含10 mmo/L四丁基溴化銨(TBA)的甲醇-水溶液(5∶95,體積比)，流動相B經三乙胺調至pH 8.0后梯度洗脫，洗脫程序為：0～1 min，55%A；1～10 min，55%～50% A；10～20 min，50%～45%A；20～35 min，45%～40%A；35～50 min，40%～55%A；流速為0.2 mL/min；柱溫為40 ℃；二極管檢測器檢測波長為350 nm；進樣體積為10 μL。

2 結果與討論

2.1 樣品預處理條件的優化

2.1.1 提取方式的選擇采用陽性樣品比較了熱水提取、振蕩提取、室溫超聲提取和加熱超聲提取4種提取方法對熒光增白劑(以FWA220和FWA113為例)提取率的影響。結果表明樣品中含有的FWA220和FWA113采用加熱超聲提取法時提取量最大，提取效果最好，熱水提取法次之，室溫超聲提取法更差，而振蕩提取法最差，故本實驗選擇加熱超聲提取法作為最佳提取方式。

2.1.2 提取試劑的選擇考察了不同提取試劑的影響。考慮到三乙胺既可調節pH值，又可起到掃尾劑的作用，本實驗選擇三乙胺調節提取試劑的pH值。參考王天嬌等[14]在測定紙質食品包裝材料中的樣品處理方法，調節提取試劑至pH 11.0，并使用陰性樣品加標，分別考察了提取試劑為20%、30%、40%、50%、60%乙腈水溶液以及50%甲醇、乙醇、丙酮水溶液時，7種水溶性熒光增白劑的回收率。結果表明，當提取試劑為40%乙腈水溶液時，7種水溶性熒光增白劑的回收率為70.0%～105%，優于其他提取試劑。因此，實驗選擇pH 11.0的40%的乙腈水溶液作為最佳提取試劑。

2.1.3 提取溫度的選擇使用陰性樣品加標，分別在室溫、30 ℃、35 ℃、40 ℃、50 ℃下進行超聲提取，計算回收率，以考察提取溫度的影響。結果表明，在50 ℃加熱超聲下，7種水溶性熒光增白劑的回收率為80.0%～101%，優于其他提取溫度。因此，本實驗選擇50 ℃進行加熱超聲。

2.1.4 提取時間的選擇使用陰性樣品加標，50 ℃加熱超聲情況下，考察了提取時間分別為1、5、10、25、35、45 min時，7種水溶性熒光增白劑的回收率。結果表明，提取時間為35 min時，7種水溶性熒光增白劑的回收率為80.0%～101%，優于其他提取時間。因此，本實驗選擇超聲提取35 min。

2.2 色譜條件優化

2.2.1 色譜柱的選擇為了使分離效果達到最佳，考察了ACQUITY UPLC BEH C18柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)、Inertsil ODS-3柱(100 mm×2.1 mm，2 μm)、CAPCELL PAK C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)、XDB-C18柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)、Eclipse XDB-C18柱(150 mm×2.1 mm，3.5 μm)、ACQUITY UPLC Amide柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)6種色譜柱的分離效果。結果表明，ACQUITY UPLC BEH C18柱可將7種熒光增白劑分離完全，而其余色譜柱無法將各組分分離完全。故選擇ACQUITY UPLC BEH C18柱進行分離。

2.2.2 柱溫的選擇分別考察了不同溫度(25、30、35、40 ℃)對分離效果的影響。結果表明，柱溫為40 ℃時分離效果最好。因此，實驗選擇最佳柱溫為40 ℃。

2.2.3 有機相的洗脫在同樣的梯度洗脫條件和離子對試劑濃度下，對比了乙腈與甲醇為有機相時對7種熒光增白劑洗脫能力的差異，結果表明，分別使用乙腈和甲醇時，7種熒光增白劑的分離效果均不佳。基于該結果，進一步考察了不同比例乙腈-甲醇混合溶劑對目標物的洗脫作用。結果表明，乙腈-甲醇體積比為1∶1時，分離效果不理想；而體積比為2∶3時，7種熒光增白劑的分離度大于1.5。因此，實驗確定乙腈-甲醇(2∶3)為最佳有機洗脫相。

2.2.4 TBA濃度的影響采用乙腈-甲醇(2∶3)為流動相A，pH 8.0的甲醇-水(5∶95)溶液為流動相B，考察了流動相B中加入TBA濃度分別為5、10、25 mmol/L時熒光增白劑的分離情況，結果表明濃度為5 mmol/L時，分離效果不好，而濃度為25 mmol/L時雖分離效果最好，但FWA71的響應值不高，且該TBA濃度對柱子的損害較大。因此，實驗選擇TBA的最佳濃度為10 mmo/L。

2.3 方法學考察

2.3.1 系統適用性試驗精密吸取“1.2”配制的混合標準儲備液和經“1.3”樣品預處理得到的供試品(紙/鋁/聚乙烯藥用復合膜)溶液各10 μL，并以乙腈和甲醇為空白對照，按“1.4”色譜條件進樣測定，結果見圖1。由圖可知，在該色譜條件下，7種水溶性熒光增白劑能達到有效的分離，理論塔板數均超過3 000，所有色譜峰的分離度均大于1.5，且空白溶劑無干擾，供試品溶液色譜峰的出峰時間和混合標準儲備液一致。

2.3.2 線性關系考察按照“1.2”方法配制標準曲線溶液，按“1.4”色譜條件進行分析，進樣體積為10 μL，以峰面積(x)為橫坐標，質量濃度(y，μg/mL)為縱坐標繪制標準曲線，計算7種水溶性熒光增白劑的線性方程和相關系數，結果如表1所示。7種水溶性熒光增白劑在各自的質量濃度范圍內呈良好線性關系，相關系數(r)為0.998 6～0.999 7。

表1 7種水溶性熒光增白劑的回歸方程、線性范圍、相關系數(r)、檢出限(LOD)及定量下限(LOQ)Table 1 Regression equations,linear ranges,correlation coefficients(r), limits of detection(LOD) and limits of quantitation(LOQ) of 7 water-soluble fluorescent whitening agents

2.3.3 定量下限與檢出限取“1.2”混合標準儲備液適量，倍比稀釋，按“1.4”色譜條件進樣測定，以信噪比10 ∶1、3 ∶1 分別計算檢出限(LOD)、定量下限(LOQ)，得到LOD為0.17～1.29 μg/mL，LOQ為0.55～3.85 μg/mL(見表1)。表明方法具有較好的靈敏度。

2.3.4 精密度試驗精密吸取混合標準儲備液10 μL，按“1.4”色譜條件連續進樣6次，記錄峰面積，結果測得7種熒光增白劑的相對標準偏差(RSD,n=6)分別為0.87%、0.55%、0.62%、0.76%、0.47%、1.1%、1.8%。表明儀器的精密度較好。

2.3.5 重復性試驗取一批藥用復合膜樣品約1 g，平行6份，精密稱定，按“1.3”方法制備供試品溶液，“1.4”色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算樣品含量。結果檢出FWA220和FWA113，其余熒光增白劑未檢出。FWA220和FWA113的平均含量分別為63.550 3、116.013 μg/g，RSD(n=6)分別為2.2%、3.2%。表明該方法的重現性良好。

2.3.6 穩定性試驗取與“2.3.5”同一批藥用復合膜樣品1份，稱量1 g左右，加入約相當于藥用復合膜含量100%的標準溶液1份，按“1.3”方法制備供試品溶液，“1.4”色譜條件進行測定，在0、2、6、10、14、18、20、24 h分別進樣1次，連續進樣8次，計算平均回收率。結果表明，7種熒光增白劑的RSD值分別為2.6%、4.3%、4.2%、3.2%、4.2%、2.7%、1.4%。表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.3.7 加標回收率試驗取與“2.3.5”同一批藥用復合膜樣品約1 g，共9份，精密稱定，加入約相當于藥用復合膜含量80%、100%、120%的標準溶液各3份，按“1.3”方法制備加標供試品溶液，“1.4”色譜條件進行測定，記錄峰面積并計算加標回收率。結果見表2，7種水溶性熒光增白劑在3種加標濃度下的平均回收率為83.2%～110%，相對標準偏差為4.0%～9.7%。方法的準確度和精密度均能滿足測定的要求。

表2 7種水溶性熒光增白劑的加標回收率及相對標準偏差(RSD)Table 2 Spiked recoveries and relative standard deviations(RSD) of 7 water-soluble fluorescent whitening agents

(續表2)

表3 樣品的測定結果(μg/g)Table 3 Determination results of samples(μg/g)

2.4 實際樣品的檢測

采用所建立的方法對來源于110個生產廠家的9個復合膜品種共191批次藥用復合膜樣品和73批次原輔材料進行檢測，結果顯示，有6批藥用復合膜樣品檢出FWA220、FWA113，有3批藥用復合膜樣品只檢出FWA220，其余的復合膜樣品均未檢出熒光增白劑，2批紙原料檢出FWA220和FWA113，結果見表3。

3 結 論

本文建立了超高效液相色譜同時測定藥用復合膜中7種水溶性熒光增白劑的方法。該方法具有前處理簡單、定量準確和靈敏度高等優點，其重現性和線性關系均能滿足定量分析要求。方法已成功用于藥用復合膜樣品中7種水溶性熒光增白劑的常規分析。由于藥用復合膜用于藥品包裝，應用廣泛，直接影響患者的用藥安全，此次檢測結果表明，仍有少量的藥用復合膜中檢出熒光增白劑，應加強熒光增白劑的檢驗監管工作，本文所提供的方法可借鑒使用。