核磁共振波譜法測定液體乳中的1,2-丙二醇

李 瑋 ，耿健強，許 華，林 立

(北京市食品安全監控和風險評估中心,北京 100094)

近年來中國奶業市場迅猛發展，液體乳產品所占市場份額巨大，特別是巴氏殺菌乳和滅菌乳以其營養價值高、便于攜帶和保存等特性占據了大片市場。國家標準中明確規定[1-3]，巴氏殺菌乳和包裝上標有“純牛(羊)奶(乳)”字樣的滅菌乳僅以生牛(羊)乳為原料，不得添加任何輔料。但還是有不法廠商，為平衡奶源質量參差不齊，掩蓋純羊奶的特殊味道，以及滿足消費者長期被誤導的對純奶口味“香”、“濃”的追求，違規向純奶產品中添加奶味香精等食品添加劑。奶味香精配方多樣，所含成分從幾種到上百種不等[4-5]，對所有成分進行一一檢測，難度較大，而且還會受純奶原本含有的風味物質的干擾，實際可操作性不強。1,2-丙二醇(1,2-Propanediol)是食品添加劑標準[3]中規定的一種食品合成香料，同時也是食品工業中食用香精、香料常用的一種優良溶劑，常態下無色近乎無味，奶味香精多用其作為載體溶劑[5-6]。因此，對純奶產品中的1,2-丙二醇進行測定，可在一定程度上間接反映產品中奶味香精的添加情況，對打擊不法廠商的違規添加行為具有現實意義。

目前，1,2-丙二醇的測定多采用氣相色譜法[7-10]，GB 5009.251-2016《食品安全國家標準 食品中1,2-丙二醇的測定》也采用氣相色譜法對液體乳中的1,2-丙二醇進行測定[11]。但氣相色譜法在實際樣品檢測中存在前處理操作繁瑣，環境友好性、經濟性差，難以避免假陽性結果，儀器檢測時間長等缺點。核磁共振(Nuclear magnetic resonance，NMR)是一種基于自旋量子數不為零的原子核的磁性波譜學技術，與氣相色譜法等色譜檢測方法相比，具有前處理過程簡單，取樣量小，專屬性強，無需對照品做參比即可同時定性、定量，脈沖組合豐富多樣，可設計多種譜編輯手段，實驗方式靈活多變等優點[12-16]。定量核磁共振( Quantitative nuclear magnetic resonance,qNMR)是建立在NMR基礎上的定量方法，具備NMR分析方法的多種優點。鑒于qNMR技術的優點，近年來，采用該技術對乳制品中糖類、脂類、氨基酸類等多種營養物質進行測定的研究報道逐漸增多[17-18]。弛豫過程是NMR現象發生后得以保持的必要條件，為確保qNMR實驗結果的準確性，應選取足夠長的弛豫延遲時間，以保證質子信號的充分弛豫[19]。但弛豫時間的提升會增加儀器的采樣時間，不利于檢測效率的提高。同時，在食品等復雜混合物體系中僅以定量峰作為qNMR法的唯一定性指標，也會存在假陽性結果風險，難以滿足檢測需求。因此，在充分發揮qNMR技術優勢的基礎上提高檢測效率，同時確保檢測結果的準確性，是當前qNMR技術在食品檢測領域應用及推廣的關鍵。

鑒于上述問題，本研究首先采用1H NMR結合選擇性一維全相關譜(1D total correlation spectroscopy，1D-TOCSY)技術，建立了液態乳中1,2-丙二醇的快速、準確定性篩查方法。在此基礎上，采用1H NMR內標定量技術建立了無需對照品的液體乳中1,2-丙二醇含量的快速測定方法，具體流程見圖1。采用上述分析方法，對市售10個品牌、批次的液體乳樣品中的1,2-丙二醇進行篩查，并將陽性樣品的測定結果與氣相色譜檢測結果進行比較。結果顯示，本方法具有前處理簡單，可避免假陽性，檢測效率高等優點，既實現了樣品的快速、精準篩查，又能準確測定目標物含量，非常適合液體乳中1,2-丙二醇的批量、快速檢測，可為乳品的質量監管提供一種快速、準確的檢測方法。

圖1 NMR法測定液體乳中1,2-丙二醇的流程圖Fig.1 Flow chart for determination of 1,2-propanediol in liquid milk by NMR method

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Bruker AVANCE 600 MHz超導傅立葉變換核磁共振儀(配有CPBBO探頭，Topspin 3.2處理軟件及60位自動進樣器，美國Bruker公司)；XS204電子天平(瑞士Mettler Toledo公司)；Centrifuge 5424R離心機(德國Eppendorf公司)；7890B氣相色譜儀(美國Agilent公司)。

1,2-丙二醇標準品(純度≥99.5%，美國Sigma公司)；重水(D2O，氘代度：99.8%)、3-(三甲基硅基)氘代丙酸鈉(TMSP)(美國CIL公司)；磷酸鹽酸緩沖溶液(PBS,pH 7.4)(美國Thermo Fisher公司)。超濾離心管(3 kD)(美國Millipore公司)，Norell 5 mm核磁管(美國Norell公司)。

10個品牌巴氏殺菌乳和滅菌乳樣品購于超市，未開啟時常溫保存，保質期內測定；開啟后密閉容器內4 ℃保存，48 h內檢測。

1.2 實驗方法

1.2.1 溶液的制備標準品儲備液配制：精密稱取1,2-丙二醇標準品適量置于容量瓶中，用去離子水溶解并定容，搖勻，制得2 mg/mL的標準品儲備液，4 ℃冰箱中儲存備用。使用時放置至室溫，按實際需要用去離子水稀釋。

樣品溶液制備：吸取1 mL液體乳樣品于4 mL的3 kD超濾離心管中，于4 ℃下以12 000 r/min離心10 min。取超濾離心得到的樣品液體420 μL于5 mm核磁管中，加入60 μL重水溶液(含5.00 μg的TMSP)和120 μL的PBS(pH 7.4)溶液，混勻后待測。

1.2.2 儀器條件1H NMR定性實驗：使用Bruker儀器脈沖程序noesypr1d，檢測溫度298 K，譜寬12 019.230 Hz，中心頻率2 814.61 Hz，脈沖延遲時間1 s，掃描次數32。

一維全相關譜(1D-TOCSY)實驗：使用Bruker儀器脈沖程序selcssfdizs，檢測溫度298 K，譜寬12 019.23 Hz，中心頻率690.80 Hz，混合時間0.5 s，掃描次數16。

1H NMR定量實驗：使用Bruker儀器脈沖程序noesypr1d，檢測溫度298 K，譜寬12 019.230 Hz，中心頻率2 814.61 Hz，脈沖延遲時間5 s，掃描次數64。

1.2.3 樣品測定及譜圖處理在“1.2.2”實驗條件下，調整儀器參數、調諧、控溫、勻場、采樣及傅立葉變換，得到圖譜。測得譜使用Bruker Topspin3.2軟件處理，變換點數為64 K，線寬因子(LB)為1.00 Hz，用指數窗函數處理，基線和相位校正均采用手動方式進行，TMSP為內標信號(δ0.00)。

1.2.4 定量計算公式以TMSP為定量內標，按公式(1)計算樣品中1,2-丙二醇的絕對含量。

(1)

式中：W為待測物的質量；A為定量峰積分面積；N為定量峰所包含的質子數；M為物質相對分子質量；下標p及t分別代表1,2-丙二醇和TMSP。

1.2.5 氣相色譜法測定[11]準確吸取1,2-丙二醇標準儲備溶液，用無水乙醇逐級稀釋，配制成質量濃度分別為0.00、2.00、5.00、10.0、20.0、50.0 μg/mL的1,2-丙二醇標準系列溶液。將標準系列工作液分別注入氣相色譜儀中，測定相應的1,2-丙二醇的色譜峰面積，以標準工作液的質量濃度為橫坐標，色譜峰的峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。準確稱取混勻液體乳樣品10 g(精確至0.01 g)于50 mL具塞比色管中，用無水乙醇定容，渦旋混勻2 min，靜置1 h后用0.45 μm 有機相濾膜過濾，所得濾液進氣相色譜儀分析。根據所得標準曲線計算樣品中1,2-丙二醇的含量。

2 結果與討論

2.1 液體乳中1,2-丙二醇的NMR定性方法

2.1.11H NMR圖譜初步定性篩查選取不含1,2-丙二醇的液體乳作為空白基質樣品，向其中添加一定量1,2-丙二醇標準品儲備液作為加標樣品。按照“1.2.1”操作方法分別制備空白樣品、加標樣品及標準品的待測溶液，測定其1H NMR譜，結果見圖2。1,2-丙二醇標準品溶液的1H NMR譜質子信號數據歸屬結果見表1。通過對比空白樣品、加標樣品及標準品的1H NMR譜(圖2A～C)可以得出，在加標樣品中，1,2-丙二醇2位的次甲基、1位的亞甲基信號峰與液體乳中的乳糖信號峰相重疊，難以分辨，僅3位的甲基質子δ1.15(d,J=6.42 Hz)信號峰與圖譜中的其他成分質子信號無重疊，易于辨識。因此采用1,2-丙二醇中甲基質子信號的化學位移值(1.15)、峰形(雙重峰)及耦合常數(6.42 Hz)信息作為液體乳中1,2-丙二醇的初步定性篩查指標。

2.1.2 1D-TOCSY圖譜二次精確定性由圖2A可以看出，液體乳基質是一個復雜的混合物體系，所含成分多樣，1H NMR圖譜組成復雜。在實際檢測工作中，僅以一個甲基質子信號作為液體乳中1,2-丙二醇的定性指標，難以避免假陽性結果出現。為提高定性結果的準確性，需在1H NMR圖譜甲基質子信號定性的基礎上進一步精確定性。1D-TOCSY為一維選擇性NMR實驗技術[20]，能夠得到激發核及與其在同一自旋體系的質子信號。1,2-丙二醇的分子結構中含有1個甲基，1個亞甲基及1個次甲基，共6個非活潑氫質子，且這6個質子均在同一自旋體系內。通過對其甲基質子信號的選擇性激發，可得到這6個質子的全相關譜。采用一維全相關脈沖對1H NMR檢測得到的陽性樣品中的δ1.15處的質子進行選擇性照射，得到選擇性1D-TOCSY圖譜。若圖譜中的信號數據與1,2-丙二醇標準品氫譜數據(表1)一致，則證明檢測樣品中δ1.15處的質子是1,2-丙二醇的甲基信號；若不一致，則表明檢測樣品中不含1,2-丙二醇成分。圖2D為加標樣品δ1.15處質子選擇性激發的1D-TOCSY圖譜，該圖與標準品圖譜(圖2C)中的化學位移、裂分形式和耦合常數完全一致。

圖2 液體乳及1,2-丙二醇標準品的NMR圖譜Fig.2 NMR spectra of liquid milk and 1,2-propanediol standard solutionA.blank sample;B.spiked sample;C.standard sample;D:1D-TOCSY spectrum of spiked sample with selective excitation of 1H(δ 1.15)

表1 1,2-丙二醇的氫譜歸屬信息表Table 1 1H NMR data of 1,2-propanediol

2.2 液體乳中1,2-丙二醇的NMR定量方法

2.2.1 定量峰與內標物的確定對定性方法篩查出的陽性樣本進行定量檢測。首先，進行定量峰和定量內標物的選定。qNMR方法中被測物質的定量特征峰應易于識別，能與樣品基質和內標物信號峰完全分離；在分子結構中最好化學環境近似(在圖譜中表現為化學位移相近)。由于在液體乳基質中，1,2-丙二醇只有3位的甲基質子信號與其他物質無重疊(圖2B)且化學位移值與TMSP最為近似。因此，選定δ1.15處的甲基質子信號作為定量峰，TMSP為定量內標物。

2.2.2 脈沖延遲時間的確定為避免樣品信號飽和，需要的定量實驗的脈沖延遲時間(D1)較長。通過設置不同的D1 時長，考察定量特征峰面積的穩定性，最終確定定量實驗的D1為5 s。

2.3 方法學考察

2.3.1 檢出限與定量下限在空白液體乳基質中，添加一定濃度的1,2-丙二醇標準品溶液，測定檢出限和定量下限。以定量質子信號峰積分面積信噪比等于5計算檢出限；定量質子信號峰積分面積信噪比等于15計算定量下限。結果顯示，本方法的檢出限為0.002 mg/mL，定量下限為0.006 mg/mL。

2.3.2 穩定性取同一空白液體乳加入一定量的1,2-丙二醇標準品儲備液，按照“1.2.1”條件制備測定樣品。分別在制備后0、2、4、8、12、24、48、72 h，于“1.2.2”條件下測定1H NMR圖譜，計算得到各時間點圖譜中1,2-丙二醇和內標TMSP定量峰比值(Ap/At)的相對標準偏差(RSD)為1.1%，確認供試品溶液在72 h內穩定性良好。

2.3.3 線性關系準確吸取一定量的標準儲備液，分別置于已加有60 μL(含5.00 μg的TMSP)重水和120 μL緩沖液的6支核磁管中，各加一定體積的去離子水至600 μL，配制成質量分別為400、200、100、50、5、2.5 μg的標準樣品，在“1.2.2”測定條件下進行1H NMR分析。以積分得到的標準品定量峰面積與內標峰峰面積比值為Y，以加入的標準品質量與加入的內標質量的比值為X作標準曲線。在標準品與內標質量比為0.5～80范圍內，得到回歸方程Y= 0.710 6X+0.119 0，r2=0.999 4，表明本方法線性關系良好。

2.3.4 回收率與相對標準偏差平行稱取同一品牌空白液體乳樣品6 份，各加入10 μL 2 mg/mL的標準品儲備液。按“1.2.1”方法制備供試溶液，在“1.2.2”定量條件下測定1H NMR圖譜，計算回收率和RSD。測得回收率為103%，RSD為1.9%,說明本方法的準確度和精密度良好。

表2 10個液體乳樣品中1,2-丙二醇的含量Table 2 Contents of 1,2-propanediol in 10 milk samples(NMR & GC)

2.4 實際樣品測定

稱取不同品牌的液體乳樣品，每個品牌樣品取3份做平行(n=3)，制備供試品溶液。按照上述建立的定性方法對樣品中的1,2-丙二醇進行篩查，并按照公式(1)計算陽性樣品中1,2-丙二醇的含量。同時采用氣相色譜法測定10 個未知樣品中1,2-丙二醇的含量，結果見表2。結果顯示，本方法與氣相色譜法的測定結果較為一致,且無需標準物質作參比,操作簡便,更適用于液體乳中1,2-丙二醇的批量、快速檢測。

2.5 與現行國標(GC)方法的對比

本文建立的NMR法對含有1,2-丙二醇的陽性樣本的檢測時長為12 min 14 s，陰性樣本僅為2 min 7 s，與現行的國標法(GC法)檢測1個樣品需19 min相比，顯著縮短了檢測時長，提高了檢測效率。同時，1H NMR與1D-TOCSY技術的結合，能夠實現陽性樣本的精確定性，避免GC方法中因存在保留時間類似物引起的假陽性結果,且無需標準品，非常適合實際檢測中液體乳中1,2-丙二醇的批量、快速檢測。

3 結 論

本研究建立了準確、快速的液體乳中1,2-丙二醇的NMR定性、定量檢測方法。首先，建立了液體乳中1,2-丙二醇的1H NMR譜快速定性檢測方法(檢測時長：2 min 7 s)，適于大批量樣品中1,2-丙二醇的快速定性篩查；其次，針對液體乳基質復雜的特點建立了液體乳中1,2-丙二醇的1D-TOCSY精準定性方法(檢測時長：1 min 35 s)，可完成對上述步驟中陽性樣本的精確定性，最大程度地避免假陽性結果；最后，建立了液體乳中1,2-丙二醇的qNMR方法(檢測時長：8 min 32 s)，可實現陽性液體乳樣本中1,2-丙二醇含量的準確測定。1H NMR、1D-TOCSY及qNMR等多種NMR方法的有機結合，在提高檢測效率的同時能夠避免假陽性結果，非常適合實際檢測中液體乳中1,2-丙二醇的批量、快速檢測，為乳品的質量監管提供了一種高效、準確的檢測方法。