清解扶正顆粒對(duì)體外淋巴管生成的抑制作用*

關(guān)建華 逯遙 朱曉勤，2 林久茂，2#

（1 福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院 福州350122；2 福建省中西醫(yī)結(jié)合老年性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 福州350122）

惡性腫瘤的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移嚴(yán)重威脅著人類的健康[1]，淋巴轉(zhuǎn)移是腫瘤轉(zhuǎn)移的最常見方式。近年來研究發(fā)現(xiàn)，淋巴管生成是促使腫瘤的生長(zhǎng)及發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移的前兆，也是預(yù)防癌癥轉(zhuǎn)移的治療靶點(diǎn)[2]，因此，通過抑制淋巴管生成從而達(dá)到抗腫瘤轉(zhuǎn)移已成為研究熱點(diǎn)[3]。有學(xué)者證實(shí)，人淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞（Human Lymphatic Endothelial Cell,HLEC）是腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的主要作用界面[4]，主要是通過誘導(dǎo)HLEC 增殖和管腔生成，為腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移提供直接通道，最終發(fā)生向遠(yuǎn)處擴(kuò)散[5]。近年來，中醫(yī)藥在腫瘤治療及預(yù)后中得到很大的運(yùn)用。本課題組研究發(fā)現(xiàn)，清解扶正顆粒（Qingjiefuzheng Granules, QFG）可以抑制肝癌細(xì)胞[6～7]和大腸癌細(xì)胞[8～10]的增殖，還能夠減輕 5-FU 化療引起的腸道損傷作用[11～12]，并且可體外抑制血管生成[13]。然而，QFG 是否可以通過抑制淋巴管生成從而發(fā)揮抑制腫瘤的作用尚不清楚，因此本研究對(duì)此進(jìn)行了探索。現(xiàn)報(bào)道如下：

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 HLEC 購(gòu)于廣州吉尼歐生物技術(shù)有限公司。

1.2 藥物配置 QFG（由福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院制劑室提供），磷酸鹽緩沖液（PBS）配置成50 mg/ml的濃度，超聲助溶后使用孔徑0.45 μm 的過濾器進(jìn)行過濾，放置于4℃冰箱內(nèi)儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑耗材 ECM 培養(yǎng)基套裝（購(gòu)于美國(guó)ScienCell 公司）；PBS（購(gòu)于美國(guó) Life technologies 公司）；DAPI 染色試劑盒（購(gòu)于江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司）；結(jié)晶紫、四唑鹽[MTT（購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司）]；遷移小室（購(gòu)于美國(guó)Corning 公司）；管腔試劑盒（購(gòu)于美國(guó)Abcam 公司）。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器 二氧化碳培養(yǎng)箱、多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo 公司）；超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備公司）；全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（美國(guó)Life 公司）；熒光顯微鏡、倒置顯微鏡系統(tǒng)（德國(guó)Leica 儀器有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HLEC 采用ECM 完全培養(yǎng)基 [胎牛血清（fetal calf serum,FBS）25 ml、內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)補(bǔ)充物（Endothelial Cell Growth supplements,ECGS）5 ml 和 青 霉 素 - 鏈 霉 素 溶 液 雙 抗（Penicillin-Streptomycin）5 ml]，置于 37℃、含 5%二氧化碳、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2 細(xì)胞活力檢測(cè) 運(yùn)用MTT 法檢測(cè)細(xì)胞活力。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HLEC 按照1×105/ml 的密度接種于96 孔培養(yǎng)板中，觀察細(xì)胞匯合度達(dá)到50%～60%時(shí)，加入 100 μl/孔含不同濃度 QFG（0、0.5、1.0、2.0 mg/ml）的培養(yǎng)液干預(yù)24 h，吸棄培養(yǎng)液，添加100 μl/孔 MTT（0.5 mg/ml）溶液繼續(xù)培養(yǎng) 4 h，吸棄后加入二甲基亞砜（DMSO）100 μl/ 孔，置于酶標(biāo)儀（波長(zhǎng)570 nm）中測(cè)定光密度（OD）值。細(xì)胞活力計(jì)算公式：細(xì)胞活力（%）=實(shí)驗(yàn)組OD 值/對(duì)照組OD 值×100%；

2.3 細(xì)胞形態(tài)觀察 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HLEC 按2×105/孔的密度接種于6 孔培養(yǎng)板中，細(xì)胞匯合度達(dá)到50%～60%時(shí)，加入不同濃度 QFG（0、0.5、1.0、2.0 mg/ml）的培養(yǎng)液干預(yù)24 h，吸棄原培養(yǎng)基并用PBS 清洗，放置于倒置顯微鏡中觀察細(xì)胞的形態(tài)變化并拍照（200×）。

2.4 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HLEC 按照1×105/ml 的密度接種到12 孔板中。當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到 50%～60%時(shí)，添加不同濃度 QFG（0、0.5、1.0、2.0 mg/ml）的培養(yǎng)液干預(yù)細(xì)胞24 h，隨后使用4%的多聚甲醛溶液固定10 min，DAPI 染色10 min，用PBS 清洗后用熒光顯微鏡（100×）拍攝。

2.5 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) HLEC 經(jīng)不同濃度QFG（0、0.5、1、2 mg/ml）的培養(yǎng)液干預(yù) 24 h 后，吸棄原培養(yǎng)基，消化離心并收集細(xì)胞，用空白ECM 培養(yǎng)基重懸以調(diào)整細(xì)胞密度為2.5×105/ml，小室內(nèi)加入200 μl重懸液（5×104個(gè)細(xì)胞），室外加入 700 μl 完全ECM 培養(yǎng)基，放入恒溫箱培育12 h 后進(jìn)行處理，吸棄原培養(yǎng)基后使用4%多聚甲醛固定和結(jié)晶紫染色各10 min，晾置干燥后，放置于倒置顯微鏡鏡下隨機(jī)選取5 個(gè)視野拍照（100×）。

2.6 管腔形成實(shí)驗(yàn) 冰上操作配置基質(zhì)膠，并鋪置于48 孔板中，隨后置于恒溫培養(yǎng)箱中凝膠1 h；凝膠期間處理QFG 干預(yù)后的HLEC，按照4×104/孔接種于基質(zhì)膠上，放置恒溫箱中孵育3 h 后置于倒置顯微鏡觀察并拍攝（100×）。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)量資料符合正態(tài)分布以（）表示，多組數(shù)據(jù)比較實(shí)用單因素變量分析，P＜0.05 表示數(shù)據(jù)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3 結(jié)果

3.1 QFG 對(duì)HLEC 的增殖能力的影響 MMT 法檢測(cè)細(xì)胞活力結(jié)果顯示，與正常組比較，QFG 干預(yù)后各組細(xì)胞活力均有不同程度的下降，活力值依次為（75.69±4.23）%、（65.68±4.35）%和 （4.76.66±2.46）%，說明QFG 對(duì)HLEC 細(xì)胞活力有抑制作用，且呈現(xiàn)濃度依賴性，并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（*P＜0.05，#P＜0.01）。見圖 1。

圖1 QFG 對(duì)HLEC 的增殖能力的影響

3.2 QFG 對(duì)HLEC 細(xì)胞形態(tài)的影響 細(xì)胞形態(tài)觀察結(jié)果顯示，與正常組比較，不同濃度的QFG 干預(yù)后，HLEC 細(xì)胞密度逐漸減小，并出現(xiàn)細(xì)胞脫落。證實(shí)QFG 對(duì)HLEC 細(xì)胞形態(tài)有著改變作用，與對(duì)細(xì)胞活力的抑制正相關(guān)，呈現(xiàn)濃度依賴性。見圖2。

圖2 QFG 對(duì)HLEC 細(xì)胞形態(tài)的影響

3.3 QFG 對(duì)HLEC 細(xì)胞凋亡的影響 DAPI 染色結(jié)果顯示，正常組的細(xì)胞存在細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，正常組的凋亡率為（10.82±3.00）%，經(jīng)不同濃度QFG 干預(yù)24 h 后，各組細(xì)胞呈現(xiàn)不同程度的凋亡現(xiàn)象，且隨著QFG 濃度增加，HLEC 細(xì)胞的凋亡率逐漸上升，其凋亡率分別為（24.26±2.41）%、（38.80±7.63）%和（69.51±9.72）%，說明 QFG 對(duì) HLEC 細(xì)胞凋亡有促進(jìn)作用，表現(xiàn)為濃度依賴性，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（*P＜0.05，#P＜0.01）。見圖 3。

圖3 QFG 對(duì)HLEC 細(xì)胞凋亡能力的影響

3.4 QFG 對(duì)HLEC 細(xì)胞損傷修復(fù)能力的影響 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，正常組HLEC 劃痕部位隨著時(shí)間延長(zhǎng)，可以出現(xiàn)逐漸修復(fù)愈合，提示我們HLEC細(xì)胞自身具有損傷修復(fù)能力；不同濃度的QFG 干預(yù)HLEC 后，隨著QFG 藥物濃度的逐漸增加，HLEC細(xì)胞損傷修復(fù)能力逐漸降低，表明QFG 對(duì)HLEC細(xì)胞損傷修復(fù)能力的具有抑制作用。見圖4。

圖4 QFG 對(duì)HLEC 細(xì)胞損傷修復(fù)能力的影響（100×）

3.5 QFG 對(duì)HLEC 細(xì)胞遷移能力的影響 遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，正常組細(xì)胞可以遷移成功，證明HLEC細(xì)胞自身具有遷移能力；經(jīng)過QFG 干預(yù)后，QFG 0.5 mg/ml 組與 1 mg/ml 組的細(xì)胞遷移率分別為（72.93±2.48）%與（10.32±0.69）%，QFG 2 mg/ml 組完全抑制HLEC 細(xì)胞的遷移能力。結(jié)果表明，QFG對(duì)HLEC 遷移能力有抑制作用，并呈現(xiàn)濃度依賴性，與正常照組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（*P＜0.05，#P＜0.01）。見圖 5。

圖5 QFG 對(duì)HLEC 細(xì)胞遷移能力的影響

3.6 QFG 對(duì)HLEC 細(xì)胞管腔生成能力的影響 管腔生成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，正常組HLEC 細(xì)胞有較多的管腔生成，提示HLEC 細(xì)胞自身具有較好的管腔生成能力；不同濃度的QFG 干預(yù)后，各組管腔生成率均得到完全抑制，與正常對(duì)照組比較具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（#P＜0.01）。結(jié)果表明，QFG 能夠?qū)?HLEC 細(xì)胞管腔生成能力有抑制作用。見圖6。

圖6 QFG 對(duì)HLEC 細(xì)胞管腔生成能力的影響

4 討論

腫瘤的轉(zhuǎn)移擴(kuò)散是癌癥發(fā)展的早期事件，從腫瘤淋巴管的轉(zhuǎn)移過程來看，主要是通過誘導(dǎo)腫瘤淋巴管生成，從而達(dá)到淋巴道轉(zhuǎn)移的目的。腫瘤淋巴管生成是轉(zhuǎn)移的重要環(huán)節(jié)，也就是淋巴道轉(zhuǎn)移的“開關(guān)點(diǎn)”[14]。目前，通過抑制淋巴管生成從而抑制腫瘤轉(zhuǎn)移是抗腫瘤轉(zhuǎn)移的研究熱點(diǎn)之一。然而，所謂淋巴管生成，是指在病理狀態(tài)下，設(shè)計(jì)多種成分和生長(zhǎng)因子等參與的復(fù)雜過程，包含有人淋巴內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移及管腔生成等過程[15～16]。HLEC 細(xì)胞的增殖、遷移及管腔生成促進(jìn)了淋巴管生成，在淋巴管生成過程中，發(fā)揮著重要作用。因此，研究抑制淋巴管生成主要就是研究藥物干預(yù)對(duì)HLEC 細(xì)胞的增殖、遷移及管腔生成能力的影響情況。

清解扶正顆粒是由白花蛇舌草、半枝蓮、炙黃芪、炒麥芽等組成，具有清熱解毒、健脾補(bǔ)氣和益氣固表等功效，常用于治療多種消化道惡性腫瘤，減輕患者不良反應(yīng)等。前期研究中，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均證實(shí)QFG 能夠抑制腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移及血管生成等，但抗腫瘤轉(zhuǎn)移中的機(jī)制需進(jìn)一步闡明，因此通過研究淋巴管生成可探索QFG 抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制。

本研究中，我們以HLEC 作為研究對(duì)象，采用不同濃度的QFG 進(jìn)行干預(yù)，觀察QFG 對(duì)淋巴管生成的影響。MTT 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，QFG 能夠抑制HLEC 細(xì)胞增殖，且具有濃度依賴性，同時(shí)可以改變HLEC 的細(xì)胞形態(tài)，二者呈現(xiàn)正相關(guān)；DAPI 染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，QFG 干預(yù)HLEC 細(xì)胞后，細(xì)胞凋亡水平逐漸增加，證實(shí)QFG 能夠促進(jìn)HLEC 細(xì)胞凋亡。此外，細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)及遷移實(shí)驗(yàn)顯示，QFG 干預(yù)HLEC 后，HLEC 的細(xì)胞損傷修復(fù)及遷移能力均得到抑制，且呈現(xiàn)出濃度依賴性。管腔生成是淋巴管生成最關(guān)鍵的過程，通過管腔生成實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)，QFG干預(yù)后，HLEC 細(xì)胞管腔生成能力得到顯著抑制，說明QFG 能夠抑制HLEC 的管腔生成能力。

綜上所述，QFG 能夠促進(jìn)HLEC 細(xì)胞凋亡，抑制HLEC 細(xì)胞增殖、遷移及管腔生成能力，從而來達(dá)到抑制淋巴管生成的作用。然而QFG 作為中藥復(fù)方，所包含的成分十分復(fù)雜，同時(shí)淋巴管生成與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的過程也是比較復(fù)雜的，需要在后續(xù)的研究中，通過多條淋巴管生成信號(hào)通路進(jìn)行深入研究，以更加完善系統(tǒng)地探討QFG 抑制淋巴管生成的作用機(jī)制。