HPLC 法同時測定魚腥草中4 種黃酮苷的含量*

廖衛波 王亞敏 戴迪 虞金寶 李晶

（江西省中醫藥研究院 南昌330046）

魚腥草為三白草科蕺菜屬植物蕺菜（Houttuynia Cordata Thunb）的全草。在我國分布廣泛，中部、東南至西南部等地區均較為常見，常生于路旁、溝邊、溪邊及林下濕地，具有清熱解毒、消腫排膿、利尿通淋之功效，應用廣泛，并且在我國西南地區人們多有種植并將其嫩根莖作為蔬菜或調味品，是一種重要的收入藥食同源全目錄名單的植物資源[1]。學者對魚腥草含量測定及藥理方面亦有諸多研究[2～4]，現代藥理研究表明魚腥草具有抗腫瘤、增強機體免疫力和抗氧化等作用，有效物質為黃酮類成分[5～7]。國內外對于魚腥草中揮發油成分的研究較多，但以黃酮類為藥效物質基礎的相關產品專利較為少見，并且在《中國藥典》2015 年版中也未明確相關黃酮類藥效成分的含量測定指標。本研究采用高效液相色譜法（HPLC），建立了同時測定魚腥草中4 種黃酮苷（蕓香苷、金絲桃苷、異槲皮苷及槲皮苷）含量的測定方法，以期為魚腥草藥材中黃酮苷類成分的含量測定及質量控制提供一定的參考。現報道如下：

1 儀器與材料

1.1 儀器 島津LC-20AD 高效液相色譜儀（LC-20AD 泵、SIL-10ADVP 控制器、SPD-20A 紫外檢測器、CTO-10ASVP 柱溫箱，購于日本島津公司）；ml-T 型萬分之一分析天平、XPR 型十萬分之一分析天平（METTLER TOLEDO 公司）；KQ-250DB型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 材料 魚腥草藥材購于樟樹市中藥材市場；蕓香苷（批號：100080-201610）、金絲桃苷（批號：111521-201708）、槲皮苷（批號：111538-201606）、異槲皮苷（批號：111809-201403），均購于中國食品藥品檢定研究院；乙腈（色譜級）；甲醇（分析純）；磷酸（分析純）；娃哈哈純凈水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱：迪馬DiamonsilTMC18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸（H3PO4）水溶液（B），按表 1 進行梯度洗脫；檢測波長：254 nm；柱溫：30 ℃；流速：1.0 ml/min；進樣量：10 μl。

表1 梯度洗脫條件

2.2 供試品溶液的制備 稱取魚腥草藥材粉末（過60 目篩）2 g，精密稱定，置于 100 ml 錐形瓶中，加入90%甲醇溶液90 ml，記錄所稱定重量，浸漬過夜（8 h）后以超聲儀超聲提取，超聲功率為100 w，頻率為40 kHz，超聲提取時間1 h，冷卻后用90%的甲醇溶液補足失重，過濾，續濾液用孔徑0.22 μm 的微孔濾膜過濾，備用。

2.3 對照品溶液的制備

2.3.1 對照品母液的制備 分別精密稱取蕓香苷、金絲桃苷、異槲皮苷及槲皮苷4 種對照品10.52 mg、10.33 mg、8.79 mg 和 9.52 mg，分別置于 10 ml容量瓶中，分別加90%甲醇溶液使溶解并定容至刻度，即配制成濃度為 1.052 mg/ml、1.033 mg/ml、0.879 mg/ml 和0.952 mg/ml 的對照品母液，備用。

2.3.2 混合對照品的制備 分別精密吸取蕓香苷、金絲桃苷、異槲皮苷及槲皮苷4 種對照品母液0.2 ml、0.6 ml、0.4 ml 和 1.0 ml 同時置于 10 ml 容量瓶中，加入90%的甲醇溶液定容至刻度，搖勻，即配制成 濃 度 分 別 為 21.04 μg/ml、61.98 μg/ml、35.16 μg/ml 和95.20 μg/ml 的混合對照品溶液，以孔徑0.22 μm 微孔濾膜過濾，備用。

2.4 分離度 精密吸取混合對照品、魚腥草供試品溶液適量，按“2.1”色譜條件下進樣測定分析，由圖可見，各成分與相鄰色譜峰均能達到有效分離，目標峰分離度均＞1.5 且各峰理論塔板數均＞3 500。見圖1。

圖1 混合對照品（A）及魚腥草供試品（B）HPLC 色譜圖

2.5 線性關系考察 吸取“2.3.2”所制混合對照品溶液，按“2.1”色譜條件分別進樣，進樣量分別為2 μl、5 μl、8 μl、10 μl、12 μl、15 μl、20 μl，以樣品質量（μg）為橫坐標，以峰面積積分值為縱坐標分別計算及繪制蕓香苷、金絲桃苷、異槲皮苷及槲皮苷4 種黃酮苷的標準曲線及其相應的線性范圍，結果顯示，蕓香苷、金絲桃苷、異槲皮苷及槲皮苷的相關系數r 分別為 0.999 8、0.999 7、0.999 8 和 0.999 6，表明 4 種黃酮苷在各自相應線性范圍內的線性關系良好。見表2。

表2 4 種黃酮苷成分線性范圍

2.6 精密度試驗 吸取“2.3.2”所制混合對照品溶液，以孔徑 0.22 μm 微孔濾膜濾過，按“2.1”色譜條件連續進樣6 次，進樣量為10 μl，分別記錄蕓香苷、金絲桃苷、異槲皮苷及槲皮苷相應峰面積并計算相應的 RSD 值，RSD 值依次為 0.34%、0.30%、0.83%及0.52%，均＜2.00%，試驗表明儀器的精密度良好。

2.7 穩定性試驗 取同一供試品溶液，室溫條件下放置，并分別于 0、2、4、8、12、16、24 h 按“2.1”色譜條件進樣，進樣量為10 μl，記錄蕓香苷、金絲桃苷、異槲皮苷及槲皮苷各色譜峰的峰面積，并計算4 種黃酮苷24 h 內各自相應峰面積的RSD 值，RSD 值依次為0.73%、0.42%、0.75%和0.68%（均＜2.00%），表明魚腥草供試品溶液在24 h 內穩定性良好。

2.8 重復性試驗 取同一批次的魚腥草粉末6 份，按“2.2”方法制備魚腥草供試品溶液，并按“2.1”色譜條件方法對其進行測定分析，進樣量為10 μl，記錄蕓香苷、金絲桃苷、異槲皮苷及槲皮苷各色譜峰的峰面積，并計算4 種黃酮苷各自相應含量的RSD 值，RSD 值依次為0.96%、1.05%、0.87%和 1.12%（均＜2.00%），表明該方法重復性良好。

2.9 回收率試驗 取同一批次魚腥草粉末9 份（約1 g），精密稱定，加入低、中、高三個不同質量濃度的混合對照品溶液，每個濃度三份，按“2.2”方法制備成供試品溶液，并按“2.1”色譜條件方法對其進行測定分析，進樣量為10 μl，記錄各色譜峰峰面積，計算回收率。結果顯示，蕓香苷、金絲桃苷、異槲皮苷及槲皮苷加樣回收率在95.16%～102.14%范圍內，RSD值均＜2.00%，表明該方法良好，準確度符合要求。見表3。

表3 回收率試驗結果

2.10 樣品含量測定 取不同批次魚腥草粉末各2 g，精密稱定，按“2.2”項下方法制備成供試品溶液，并按“2.1”項下色譜條件方法測定分析，進樣量為10 μl，記錄蕓香苷、金絲桃苷、異槲皮苷及槲皮苷的色譜峰面積，計算4 種黃酮苷各自相應的含量。結果顯示，三批樣品中4 種黃酮苷蕓香苷、金絲桃苷、異槲皮苷及槲皮苷的含量存在一定的差異，蕓香苷、金絲桃苷、異槲皮苷及槲皮苷的平均含量分別為0.70 mg/g、2.97 mg/g、0.68 mg/g 和 4.44 mg/g，總含量約占8.80 mg/g。金絲桃苷和槲皮苷的含量較高，僅二者即占總含量的7.41 mg/g。見表4。

表4 樣品含量測定

3 討論

魚腥草作為重要的藥食同源植物，其藥用價值應用廣泛，單一指標的質量評價對其質量控制存在一定的不足，不能很好反映藥材質量的優劣。黃酮類成分作為魚腥草有效物質，其含量測定尤為重要[8～9]，本研究以HPLC 法建立了同時測定4 種黃酮苷含量的方法，為其質量評價提供了一定參考。

魚腥草中蕓香苷、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮苷4 種成分均屬于黃酮苷類化合物，易溶于水及甲醇等較強極性的溶劑中，本研究前期分別選擇（50%、75%、90%）甲醇、純甲醇、（50%、75%、90%）乙醇及水等多種不同溶劑作為提取溶劑，探究優選最佳提取溶劑，結果表明，以90%的甲醇作為提取溶劑時4種目標產物均能達到較完全的提取效果，且雜質干擾較少。本研究中針對金絲桃苷與異槲皮苷分離度不佳及峰拖尾等問題，采用梯度洗脫，以乙腈-0.1%H3PO4為流動相，并適當延遲出峰時間的方式，最終獲得了較好的分離效果。

此外，本研究的方法學考察結果顯示，該方法操作簡便，具有較高的準確度，靈敏度及穩定性。通過測定魚腥草中蕓香苷、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮苷4 種黃酮苷成分的含量，能提高魚腥草藥材在質量控制方面的準確性及可控性，對其應用及開發有重要的意義。