通過礦化提高蛋白疫苗穩定性的研究①

閔婭君 肖云菊 肖江明 胥文春 尹一兵 張雪梅

(重慶醫科大學檢驗醫學院臨床檢驗診斷學教育部重點實驗室,重慶 400016)

肺炎鏈球菌 (streptococcus pneumoniae，S.pn) 作為社區獲得性肺炎的主要致病菌，還可引起肺炎、腦膜炎、敗血癥等嚴重的侵襲性疾病，而疫苗是預防傳染性疾病最經濟、有效的手段[1]。蛋白疫苗因其保守性高、抗原性強、易于制備且能有效激活B、T細胞免疫等優點，已成為下一代肺炎鏈球菌疫苗的研究重點[2，3]。但蛋白疫苗對溫度極其敏感，從生產到運輸全過程都需要嚴格低溫保存，極大地增加了疫苗的使用成本，限制了疫苗的廣泛應用[4]。因此，提高蛋白質的穩定性對蛋白質疫苗的應用具有重要意義。

肺炎鏈球菌溶血素(pneumolysin，PLY)是肺炎鏈球菌的一種重要毒力因子，作為膽固醇依賴性細胞溶血素(CDCs)的家族成員，可廣泛作用于宿主組織細胞，發揮細胞毒性作用。ΔA146PLY 作為PLY的無溶血活性突變體，被證明是一種安全高效的肺炎鏈球菌候選疫苗[5]。本研究擬以肺炎鏈球菌ΔA146PLY為研究對象，利用原位仿生礦化技術為其包裹上一層磷酸鈣外殼，通過酶解反應和熱處理觀察其穩定性，并通過細胞實驗及動物實驗評估礦化疫苗ΔA146PLY@CaP的免疫保護效果，以進一步確定其穩定性。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株與動物 WT-PLYE.coliBL21和ΔA146PLYE.coliBL21菌株由重慶醫科大學臨床檢驗診斷學教育部重點實驗室制備與保存；大腸桿菌感受態細胞BL21(DE3)購自擎科生物科技有限公司；肺炎鏈球菌臨床菌株CMCC31693(血清型19F型)購自中國醫學微生物菌種保藏管理中心；野生昆明鼠購自重慶醫科大學實驗動物中心；6～8周齡C57BL/6雌性小鼠購自北京華阜康生物科技股份有限公司，飼養于SPF級清潔動物房。

1.1.2試劑 Ni-NTA 樹脂購自GE healthcare中國公司；去內毒素試劑盒購自南京金瑞斯生物科技；氯化鈣、氯化鎂購自生工生物工程(上海)股份有限公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉購自重慶川東化工(集團)有限公司；考馬斯亮藍(G-250,R-250)購自生工生物工程(上海)股份有限公司；Protein Molecular Weight Marker購自寶生物工程(大連)有限公司(TaKaRa)公司；預染marker購自Thermo Fisher SCIENTIFIC公司；SDS-PAGE試劑盒，青鏈霉素、卡那霉素購自碧云天生物公司；RMPI1640培養基購自Hyclone 公司；胎牛血清購自ScienCell；紅細胞裂解液購自天根生化科技有限公司；ELISA MAXTMDeluxe SET mouse IL-6、TNF-α試劑盒購自Biolegend公司；辣根過氧化物酶(HRP)標記山羊抗小鼠IgG購自北京中杉金橋公司。

1.1.3儀器 掃描電鏡(FESEM，Hitachi SU8010)、透射電鏡(TEM，Hitachi H-7500)，能量色散X射線光譜儀(EDS，Oxford Instruments)；紫外分光光度計(Thermo Scientific,Nanodrop 1000)；冷凍干燥機(CHRIST,RVC2-18); 酶標儀(Gene Company Limited,EON)。

1.2方法

1.2.1蛋白WT-PLY和ΔA146PLY的表達純化與內毒素去除 將E.coliBL21-WT-PLY和E.coliBL21-ΔA146PLY 菌株活化于5 ml含50 ng/ml卡那霉素的LB液體培養基，置于搖床，37℃，180 r/min。A600≈0.5(約7 h)時將5 ml活化菌液加入到含卡那霉素終濃度為50 ng/ml的500 ml LB培養基中，置于搖床，37℃，180 r/min。搖床培養約4 h后加入1 mol/L IPTG至終濃度0.5 mmol/L，25℃，120 r/min誘導蛋白表達8 h。5 000 r/min，4℃離心收集細菌，超聲破菌后以4℃ 12 000 r/min離心30 min并收集上清，0.22 μm濾器過濾；Ni-NTA親和層析法進行蛋白純化，超濾后用試劑盒去內毒素并用10%SDS-PAGE進行純度鑒定。使用紫外分光光度計檢測所得蛋白濃度，分裝后于-80℃保存備用。

1.2.2蛋白WT-PLY和ΔA146PLY的生物礦化 將 360 μg蛋白WT-PLY和ΔA146PLY分別與8.8 μmol CaCl2、8.8 μmol MgCl2以及5.28 μmol Na2HPO4/NaH2PO4(pH=7.5)緩沖液混合，其余體積用ddH2O(pH=7.5)補足至1 ml。用DEPC處理過的磁珠與礦化體系盛放于燒杯，4℃攪拌4 h后備用。分別取礦化懸濁液40 μl，4℃ 3 000 r/min 離心5 min，分離上清和沉淀，40 μl上清中加入10 μl 5×loading buffer，沉淀中加入50 μl 1×loading buffer，沸水煮10 min，分別取20 μl樣本進行SDS-PAGE分析。另外取部分礦化液，分離上清，用BCA蛋白測定試劑盒檢測上清中殘余的蛋白含量。

1.2.3礦化納米顆粒WT-PLY@CaP和ΔA146PLY@CaP的表征

1.2.3.1TEM 將WT-PLY@CaP和ΔA146PLY@CaP礦化懸濁液分別用PBS稀釋50倍后，滴于200目銅網上，自然晾干，隨后在透射電鏡中檢測礦化蛋白的大小。

1.2.3.2FESEM 將WT-PLY@CaP和ΔA146PLY@CaP礦化懸濁液分別用無水乙醇稀釋10倍后，滴于二氧化硅玻片上，自然晾干后噴金，隨后掃描電鏡檢測礦化蛋白的表面形貌。

1.2.3.3EDS 將WT-PLY@CaP和ΔA146PLY@CaP礦化懸濁液3 000 r/min離心后，棄上清，沉淀用無水乙醇清洗2遍后，置于冷凍干燥機凍干后將粉末送去檢測：將其鋪于碳膠帶上，采用EDS檢測礦化顆粒表面的元素組成。

1.2.4蛋白與納米顆粒的穩定性檢測

1.2.4.1蛋白酶K降解實驗 將WT-PLY蛋白和礦化后的WT-PLY@CaP懸濁液用40 μg/ml的蛋白酶K分別處理0、1、5、10、15 min，ΔA146PLY蛋白和ΔA146PLY@CaP用15 μg/ml的蛋白酶K分別處理0、1、5、10、15 min。加入1 μl FMSF終止酶解反應，之后加入loading buffer，煮沸10 min后取20 μl上樣于SDS-PAGE的上樣孔中，80 V×40 min后120 V×80 min 跑膠。用考馬斯亮藍染色后再用洗脫液洗脫。

1.2.4.2溶血實驗 取野生昆明鼠心臟血制備2%紅細胞懸液備用。將WT-PLY和WT-PLY@CaP分別放置在45℃、55℃處理不同時間后取20 μl蛋白及處理后的懸濁液到300 μl 2%紅細胞懸液中，反應10 min，800 g離心5 min，取上清150 μl加入至96孔板，在545 nm處比色。

1.2.5小鼠巨噬細胞的提取與體外培養 吸取無菌石蠟1 ml，注入小鼠腹腔以刺激腹腔巨噬細胞產生；5 d后斷頸處死小鼠于75%乙醇浸泡5 min；從下腹部側緣破開腹腔，分別用7 ml+8 ml預冷的PBS沖擊腹腔，回收的PBS 1 000 r/min離心5 min，棄去上層石蠟，PBS洗1次之后，加入紅細胞裂解液5 ml，作用2 min，PBS洗3次，加入新鮮含雙抗(青霉素和鏈霉素)培養基(DMEM)5 ml，計數并稀釋后鋪板于24孔板(5×105個/孔，500 μl/孔)；置于37℃、5%CO2培養箱，培養過夜后每孔加入15 μl分別用45℃和55℃處理的ΔA146PLY和ΔA146PLY@CaP，以等量LPS作為陽性對照，無菌PBS作為陰性對照。

1.2.6動物實驗

1.2.6.1皮下免疫小鼠 將C57BL/6小鼠隨機分為8組，1.5%戊巴比妥鈉麻醉，共免疫 3次，每次免疫間隔14 d。

1.2.6.2鼻腔定植 末次免疫7 d后取20 μl含有1×108CFU的19F以滴鼻的方式攻毒，每組6只，72 h后在小鼠被麻醉的狀態下收集鼻腔灌洗液(100 μl/只)及肺勻漿(每組>4只)，分別鋪板計算細菌載量；肺勻漿12 000 r/min離心10 min后收集上清以檢測細胞因子含量。

1.2.7酶聯免疫法檢測細胞因子及抗體水平 于末次免疫7 d后取小鼠尾靜脈血，分離血清用于檢測抗體效價；用抗原包被液將蛋白ΔA146PLY稀釋至5 μg/ml，加入96孔板，100 μl/孔，4℃過夜；洗板(洗液：0.05%PBST)3次，加入封閉液(2%BSA)，200 μl/孔，37℃×2 h；洗板3次后加末次免疫7 d后所得血清，進行連續倍比稀釋，100 μl/孔，最后一孔(100 μl，2%BSA)為陰性對照，37℃×1 h；洗板6次后加HRP標記的山羊抗小鼠二抗，100 μl/孔，37℃×45 min；洗板6次后分別加入A、B顯色液各50 μl，37℃15 min；100 μl/孔、2 mol/L硫酸終止反應；450 nm測定吸光度值；以A空白×2.1為臨界值，計算各小鼠的抗體效價滴度。IL-6、TNF-α的濃度均由ELISA MAXTMDeluxe SET mouse IL-6、TNF-α、試劑盒按其說明書進行檢測，在450 nm處比色測定吸光度值，并依據標準曲線計算出相應細胞因子含量。

1.3統計學分析 數據的作圖及統計學分析均使用軟件Graphpad Prism(Prism 5；Graphpad Software，La Jolla,CA,USA)完成?？贵w效價使用Mann-WhitneyU檢驗進行分析；細菌載量、細胞因子使用非配對t檢驗進行分析，P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1蛋白的表達與純化 通過肺炎鏈球菌溶血素PLY溶血活性的變化觀察蛋白礦化后的穩定性，在表達ΔA146PLY的同時也表達其具野生型蛋白WT-PLY，以便于后續研究。以1 mol/L IPTG，20℃×120 r/min誘導表達蛋白WT-PLY和ΔA146PLY，Ni-NTA柱純化并用去內毒素試劑盒去除蛋白的內毒素(LPS<0.1 EU/μg)后以10% SDS-PAGE分析所得蛋白，G-250染色后于53 kD處見目的條帶，大小與相應蛋白相對分子量相符，灰度分析顯示純度均達90%以上(圖1)，可用于后續實驗。

圖1 蛋白WT-PLY和ΔA146PLY原核表達、純化后SDS-PAGE分析Fig.1 Prokaryotic expressions of WT-PLY and ΔA146 PLY and SDS-PAGE analysis after purificationNote:A.Protein WT-PLY; B.Protein ΔA146PLY.M.DL 200 kD marker; 1.WT-PLY protein；2.Protein ΔA146PLY.

圖2 礦化后蛋白納米顆粒的表達效果及SDS-PAGE、BCA結果Fig.2 Expression of protein nanoparticles after mineralization and SDS-PAGE,BCA resultsNote:A.Comparison of WT-PLY mineralization effect (1.WT-PLY; 2.WT-PLY@CaP); B.WT-PLY@CaP SDS-PAGE analysis (M.Protein marker; 1.WT-PLY; 2.WT-PLY@CaP supernatant; 3.WT-PLY@CaP precipitation); C.WT-PLY@CaP BCA test result chart; D.Comparison of ΔA146PLY mineralization effect (1.ΔA146PLY; 2.ΔA146PLY @CaP); E.ΔA146PLY@CaP SDS-PAGE analysis (M.Protein marker; 1.ΔA146PLY;2.ΔA146PLY@CaP supernatant; 3.ΔA146PLY@CaP precipita-tion);F.ΔA146PLY@CaP BCA test results.

2.2蛋白的生物礦化及包封率分析 礦化結果顯示：蛋白礦化后呈懸濁液，與蛋白溶液相比，呈現比較明顯的半透明狀(圖2A、D)。分離礦化液上清和沉淀，進行SDS-PAGE，灰度分析結果顯示WT-PLY@CaP上清中蛋白含量為51.3%，沉淀中為40.6%；ΔA146PLY@CaP蛋白含量為51.6%，沉淀中為44.7%(圖2B、E)。將礦化懸濁液的上清液用BCA試劑盒檢測， WT-PLY上清中含量為55.6%，ΔA146PLY含量為47.8%，即生物礦化之后的包封率分別為44.4%和52.2%(圖2C、F)。

2.3礦化納米顆粒的生物表征

2.3.1TEM 可溶性蛋白WT-PLY和ΔA146PLY是柔性分子，分子直徑約20 nm，因其不能承受普通透射電子顯微鏡高速的電子束轟擊，所以無法通過TEM觀測其大小。但是經過原位礦化之后，礦化顆粒具有一定的厚度和體積，在電子束轟擊下不會降解分離，可以在電鏡下呈現出一定的大小和形態。通過TEM觀察產物大小和形狀(圖3)，發現磷酸鈣-蛋白質的復合物呈現為單分散的近球形納米顆粒，大小不一，直徑約100 nm。

圖3 WT-PLY@CaP和ΔA146PLY@CaP的TEM圖

圖4 WT-PLY@CaP和ΔA146PLY@CaP的FESEM圖

2.3.2FESEM 通過FESEM觀察產物表面形貌(圖4)，發現磷酸鈣-蛋白質的復合物呈現為表面較光滑的近球形納米顆粒，盡管大小不一，但是大多數直徑100 nm左右，同TEM的結果相似。

圖5 WT-PLY@CaP和ΔA146PLY@CaP的EDS圖

圖6 蛋白WT-PLY、ΔA146PLY及其礦化顆粒蛋白酶K處理后SDS-PAGE結果分析

2.3.3EDS EDS分析結果(圖5)表明蛋白磷酸鈣納米復合物中含有Ca、Mg、P等元素，其中WT-PLY@CaP Ca、Mg、P的含量分別為41.94%、15.86%、42.21%；ΔA146PLY @CaP Ca、Mg、P的含量分別為49.38%、7.69%、42.93%(鈣磷比約為1∶1)，這也進一步證明生物礦化確實將磷酸鈣包裹于自身。

2.4蛋白與礦化顆粒的穩定性評估

2.4.1蛋白酶K降解實驗 對蛋白WT-PLY和礦化顆粒WT-PLY@CaP蛋白酶K處理后，可以看出，隨著時間的延長，蛋白基本降解，但是礦化顆粒仍然殘留部分；同理，蛋白ΔA146PLY在15 min后幾乎無殘余，但是礦化顆粒相較于游離蛋白仍剩余較多(圖6)，而且降解速度上，無論WT-PLY@CaP還是ΔA146PLY@CaP，其抵抗蛋白酶作用的耐受性仍然高于游離蛋白WT-PLY以及ΔA146PLY。

圖7 熱處理后WT-PLY和WT-PLY@CaP的溶血對比圖

圖8 不同溫度處理ΔA146PLY和ΔA146PLY@CaP后刺激巨噬細胞分泌細胞因子IL-6和TNF-αFig.8 Treatment of cytokines IL-6 and TNF-α by macrophages after treatment with ΔA146PLY and ΔA146PLY@CaP at different temperaturesNote:*.P<0.05;**.P<0.01；***.P<0.001.

圖9 礦化蛋白熱處理后小鼠的免疫保護效應Fig.9 Immune protective effect of mice after heat treatment of mineralized proteinNote:A.Anti-ΔA146PLY IgG antibody titer of subcutaneous immunized mice after heat treatment of mineralized protein;B.Colony count of nasal lavage fluid after 72 h of nasal infection;C,D.Inflammation of the lung produces IL-6 and TNF-α levels after 72 h of nasal infection.Compared with the PBS group,*.P<0.05,**.P<0.01,***.P<0.001;compared with the ΔA146PLY group,★.P<0.05;compared with the ΔA146PLY inactivation treatment group,#.P<0.05,##.P<0.01.

2.4.2溶血實驗 采用溶血實驗進行蛋白的熱穩定性評估，結果顯示在55℃處理后，WT-PLY蛋白在3 min后完全失活，而WT-PLY@CaP在20 min之后仍保留部分溶血活性；45℃處理后，WT-PLY蛋白在0.5 h后完全失活，而WT-PLY@CaP在24 h后仍然保留有部分溶血活性。結果顯示，生物礦化后的WT-PLY@CaP可以提高WT-PLY蛋白在較高溫度下的熱穩定性(圖7)。

2.5礦化蛋白熱處理后仍可有效激活巨噬細胞 采用疫苗蛋白對巨噬細胞的激活效應探索礦化蛋白對熱的穩定性，結果顯示：在較高溫度處理后的蛋白基本失去刺激活性，但是進行生物礦化之后的ΔA146PLY@CaP仍然可以刺激巨噬細胞分泌較高的IL-6和TNF-α，具有明顯的差異(圖8)，提示ΔA146PLY進行生物礦化之后可顯著提高蛋白在較高溫度下的熱穩定性。

2.6礦化蛋白熱處理后仍可誘導小鼠的免疫保護效應 采用免疫保護作用進行蛋白熱穩定性評估，結果顯示(圖9A)熱處理之后的ΔA146PLY@CaP(45℃和55℃)與未經處理組蛋白ΔA146PLY相比無差異，都具有較高的抗體效價，熱處理后的ΔA146PLY抗體效價較未處理組顯著降低，提示生物礦化之后的蛋白確實能抵抗較高的溫度，且在處理后仍具有生物活性。

鼻腔灌洗液結果顯示(圖9B)，熱處理之后的ΔA146PLY@CaP(45℃和55℃)與未處理組蛋白ΔA146PLY的菌落計數無顯著差異(P>0.05)，都較PBS組和蛋白滅活處理組顯著降低(P<0.01)；熱處理之后的ΔA146PLY@CaP(45℃和55℃)與未處理蛋白ΔA146PLY的IL-6和TNF-α水平差異無統計學意義，都較對照組(滅活蛋白組、ACP加蛋白組和PBS組)的水平顯著降低。這些結果提示，熱處理后的ΔA146PLY@CaP可以降低肺炎鏈球菌鼻咽部定植量，仍可以保持與原蛋白相當的免疫保護效應。

3 討論

目前，提高蛋白質熱穩定性的方法主要有以下幾種：①非共價修飾，主要是通過物理方法提高蛋白質的穩定性，包括反相膠束法、凍融法和凍干法等[6,7]；②化學修飾，主要是通過化學手段將其他分子共計連接到蛋白質分子上，以改變它們的生物分配行為和溶解行為，從而增強藥物的物理、化學和生物穩定性，包括化學交聯、聚合物修飾、小分子修飾等[8-12]；③添加蛋白質穩定劑，最簡單有效的添加劑是離子化合物的鹽類，離子的結合能增加蛋白質的熱穩定性，鹽類通過與蛋白質非特異性結合，減緩蛋白質的變性；④蛋白質工程，通過化學、物理、分子生物學手段對基因進行修飾或合成新的基因，對現有蛋白質進行高度專一的改造，從而起到增強蛋白質穩定性的作用[13]；⑤在液體狀態，利用礦化技術直接在蛋白表面形成磷酸鈣礦化外殼以提高蛋白質的穩定性。然而，方法①在凍融或凍干蛋白過程中易使蛋白分解失活；方法②③④一般需要復雜的處理過程且普適性低；方法④尚不能產生良好的保護效果，而且可能會改變蛋白質的性質，影響蛋白質的效果。方法⑤的策略是模擬自然現象給蛋白分子加上一層具有保護作用的礦化外殼。生物礦化在自然界中普遍存在，生物體通過生物礦化形成具有一定結構的有機-無機復合組分，為較脆弱的本體提供機械支持和保護，提高它們在不利環境中的穩定性[14]。該法相對簡便易行，在病毒和細菌等活的生物體中都有良好的效果[15,16]。目前被用于礦化研究的物質有多種類型，包括磷酸鈣、碳酸鈣、二氧化硅等，其中磷酸鈣為生物體內所熟知的骨骼、牙齒的主要成分，以磷酸鈣作為藥物材料具有優良的生物相容性和生物可降解性[17-22]。同時磷酸鈣也可以作為佐劑來促進免疫抗原的作用效果，且不會像鋁佐劑一樣引起較大的局部組織刺激[23，24]。納米級的蛋白磷酸鈣制劑因具有可被免疫細胞攝取和遞呈引發免疫反應等優勢而具有廣闊的應用前景[25]。因此，采用磷酸鈣制備生物礦化殼是一種良好的選擇。

在實驗過程中，蛋白質的原位礦化是分別取360 μl WT-PLY蛋白和ΔA146PLY蛋白(1 mg/ml)與88 μl CaCl2(0.1 mol/L，pH=7.5)和Na2HPO4/NaH2PO4(0.1 mol/L，pH=7.5)以及ddH2O(pH=7.5)組成1 ml礦化體系，用攪拌子在4℃勻速攪拌4 h形成WT-PLY@CaP和ΔA146PLY@CaP礦化顆粒。因為前期實驗發現礦化體系不穩定，所以在礦化反應體系中加入88 μl MgCl2(0.1 mol/L)作為礦物無定形相的穩定劑，抑制礦物發生相轉變[26]。Mg2+可以通過摻雜于無定形磷酸鈣顆粒內部或吸附于顆粒表面起到穩定礦物無定形態的作用[27]。

但是遺憾的是，雖然鎂離子可以提高礦化體系的穩定性，但是礦化顆粒在37℃放置14 d后以及25℃放置60 d后并沒有表現出更好的穩定性，其可能與本研究的體系尚不完全穩定有關。本研究發現放置多天后，礦化顆粒聚集沉淀，顆粒顯著增大，且不能恢復成納米狀態。因此，擬采用添加穩定劑的方法來提高，之前嘗試添加蔗糖、聚乙二醇(不同分子量、不同濃度)、PVP等，都沒有顯著提高礦化體系的穩定性。所以，本課題組擬再選擇其他穩定劑或是將以上穩定劑的濃度更改之后再進一步研究。另外，也可能是蛋白自身的結合能力較弱，本課題組擬偶聯礦化肽提高其磷酸鈣的結合能力，或許能獲得更穩定的礦化蛋白。

本研究通過較為簡便的原位礦化技術進行生物礦化后，蛋白可以形成具有礦化外殼的納米顆粒，該納米顆粒具有一定的抗蛋白酶K降解能力和高溫耐受性。△A146PLY疫苗蛋白形成的礦化納米顆粒在45℃和55℃處理后仍保持與原蛋白一致的免疫活性。本研究也為穩定性蛋白質制劑的制備提供了有價值的實驗依據和理論參考。