強(qiáng)直性脊柱炎患者外周血CD4+CD25highCD127low、CD8+CD28-調(diào)節(jié)性T細(xì)胞水平變化及臨床意義①

張 宇 馬 莉 吳青青 沈 雪

(貴州醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院，貴陽(yáng) 550004)

強(qiáng)直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS)是以骶髂關(guān)節(jié)和脊柱附著點(diǎn)炎癥及椎間盤纖維環(huán)及附近結(jié)締組織纖維化、骨化和關(guān)節(jié)強(qiáng)直為主要特征的慢性炎癥性自身免疫性疾病，在我國(guó)的患病率約為0.2%～0.3%，以青年男性為主，病程較長(zhǎng)，致殘率較高[1-3]。目前AS病因及發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，研究認(rèn)為其發(fā)生發(fā)展與T細(xì)胞異常激活、細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)功能紊亂、淋巴細(xì)胞亞群比例失衡或功能異常相關(guān)[4-6]。

調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells，Treg)是一類具有免疫負(fù)調(diào)控功能的CD4+T細(xì)胞亞群，可通過(guò)分泌抑制性細(xì)胞因子(IL-10，TGF-β)或抑制細(xì)胞間接觸等途徑抑制效應(yīng)T細(xì)胞(Th)增殖、活化和炎癥細(xì)胞因子分泌，維持自身免疫耐受并發(fā)揮抗炎作用[7,8]。多種自身免疫性疾病已證實(shí)不同表型的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞存在數(shù)量和功能上的失衡，但不同表型Treg在AS患者體內(nèi)是否均存在異常及其與病情活動(dòng)度、炎癥動(dòng)指標(biāo)的關(guān)系尚未闡明。因此，本研究通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)(FCM)及流式細(xì)胞微球芯片捕獲術(shù)(CBA)檢測(cè)不同活動(dòng)期AS患者外周血CD4+CD25highCD127lowTreg、CD8+CD28-Treg、IL-2、IL-6、TNF-α、IFN-γ、IL-17A水平，分析Treg與疾病活動(dòng)度、炎癥活動(dòng)指標(biāo)的關(guān)系，并探討其在AS發(fā)生發(fā)展中的臨床意義。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1研究對(duì)象 選取2017年9月～2019年3月于我院骨科、風(fēng)濕免疫科門診首次確診的AS患者77例，其中男性67例，女性10例，年齡14～48歲，平均年齡(28.61±8.26)歲，病程1個(gè)月～32年，平均病程(5.62±5.80)年，HLA-B27均為陽(yáng)性，診斷標(biāo)準(zhǔn)符合美國(guó)風(fēng)濕病協(xié)會(huì)(ACR)1984年修訂的AS診斷標(biāo)準(zhǔn)，且未接受過(guò)抗風(fēng)濕藥物及生物制劑等治療[9]。根據(jù)Bath AS疾病活動(dòng)指數(shù)評(píng)分(BASDAI)將AS患者分為AS非活動(dòng)組47例(inactive AS group，BASDAI<4，男性42例、女性5例)和AS活動(dòng)組30例(active AS group，BASDAI≥4，男性25例、女性5例)。另選擇同期在我院體檢中心體檢的健康志愿者59例作為健康對(duì)照組(healthy control group,HC組)，男性43例，女性16例，年齡19～42歲，平均年齡(27.40±5.01)歲，心、肝、腎功能正常，排除標(biāo)準(zhǔn)同實(shí)驗(yàn)組。本研究經(jīng)貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院倫理學(xué)委員會(huì)審核批準(zhǔn)(批件號(hào)：2019030K)，所有研究對(duì)象均知情同意。所有志愿者入組后指導(dǎo)填寫病例調(diào)查表和Bath AS BASDAI評(píng)分表，檢測(cè)疾病炎性活動(dòng)指標(biāo)紅細(xì)胞沉降率(ESR)和超敏C反應(yīng)蛋白(Hs-CRP)水平。

1.1.2排除標(biāo)準(zhǔn) ①合并風(fēng)濕病、其他自身免疫性疾病及炎癥疾病者；②合并血液系統(tǒng)及肝腎疾病者；③近3個(gè)月內(nèi)接受糖皮質(zhì)激素、羥氯喹或其他免疫抑制劑治療者；④妊娠期或哺乳期女性；⑤病程少于1個(gè)月者。

1.1.3儀器與試劑 儀器 FACSCantoTMⅡ流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)，WXH微型旋渦混合器(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)，低速離心機(jī)(上海手術(shù)器械廠)；試劑 FITC-鼠抗人CD8、FITC-鼠抗人CD4、PE-鼠抗人CD127、PE-鼠抗人CD28、APC-鼠抗人CD25、PE-CY7-鼠抗人CD3抗體，同型對(duì)照抗體FITC-鼠抗人IgG1、PE-鼠抗人IgG1、APC-鼠抗人IgG1，HLA-B27檢測(cè)試劑盒，磷酸緩沖液(PBS)，F(xiàn)ACSTM Lysing solution紅細(xì)胞裂解液均購(gòu)自美國(guó)BD公司，Th1/Th2/Th17細(xì)胞因子檢測(cè)試劑盒(杭州賽基生物有限公司)。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本采集 上午8：00～9：30空腹采集靜脈全血2 ml，EDTA-K2抗凝，用于Treg細(xì)胞檢測(cè)；采集外周靜脈血5 ml于不添加抗凝劑的干燥管，3 800 r/min 離心15 min，收集血清，-80℃儲(chǔ)存，待細(xì)胞因子檢測(cè)。

1.2.2Treg檢測(cè) 取抗凝靜脈全血50 μl于4支流式檢測(cè)管，編號(hào)為1、2、3、4，分別向流式檢測(cè)管1和同型對(duì)照管3加入FITC-鼠抗人CD4、PE-鼠抗人CD127、APC-鼠抗人CD25熒光抗體及對(duì)應(yīng)的同型抗體，流式檢測(cè)管2和同型對(duì)照管4加入FITC-鼠抗人CD8、PE-鼠抗人CD28、PE-CY7-鼠抗人CD3熒光抗體及對(duì)應(yīng)的同型對(duì)照抗體，每種抗體量均為5 μl，渦旋混勻，室溫避光孵育30 min，加入10×紅細(xì)胞裂解液2 ml，搖勻后室溫避光孵育10 min，待紅細(xì)胞完全溶解后，加入3 ml PBS充分混勻，1 500 r/min離心5 min，棄上清，重復(fù)1次，加入500 μl PBS重懸細(xì)胞，上機(jī)檢測(cè)。利用前向散射角(FSC)和側(cè)向散射角(SSC)設(shè)置門圈取淋巴細(xì)胞，再分別利用SSC和CD4、SSC和CD8設(shè)門圈取CD4+淋巴細(xì)胞、CD8+淋巴細(xì)胞，檢測(cè)CD4+淋巴細(xì)胞上CD25與CD127和CD8+淋巴細(xì)胞上CD28表達(dá)，計(jì)算CD4+CD25highCD127lowTreg占CD4+T淋巴細(xì)胞、CD8+CD28-Treg占總淋巴細(xì)胞的比例。Diva和Flowjo軟件分析數(shù)據(jù)，各樣本細(xì)胞數(shù)至少為1×105個(gè)/次。

1.2.3細(xì)胞因子測(cè)定 ①孵育捕獲微球：取捕獲微球混合液于試管中并標(biāo)記，旋渦振蕩10～15 s，1 000 r/min 離心5 min，棄上清，加入與所棄上清等量的微球緩沖液重懸微球，旋渦振蕩3～5 s，避光孵育30 min；②配制標(biāo)準(zhǔn)品：根據(jù)試劑說(shuō)明書將最高濃度標(biāo)準(zhǔn)品5 000 pg/ml依次按1∶2，1∶4，1∶8，1∶16，1∶32，1∶64，1∶128，1∶256，1∶512稀釋；③配置樣本管：取25 μl患者血清加入檢測(cè)管，每管分別加入25 μl 孵育好的捕獲微球，振蕩混勻；④向標(biāo)記為1∶2，1∶4，1∶8至1:512的標(biāo)準(zhǔn)管中加入25 μl對(duì)應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，再加入25 μl捕獲微球；⑤向上述標(biāo)準(zhǔn)管和樣本管中分別加入25 μl PE熒光標(biāo)記的捕獲抗體，振蕩混勻，室溫避光孵育2.5 h；⑥每管加入1 ml PBS溶液洗滌，200 g離心5 min，棄上清；⑦每管加入100 μl PBS溶液，振蕩重懸后行流式細(xì)胞檢測(cè)，F(xiàn)CAP Array軟件分析計(jì)算結(jié)果。

1.2.4炎癥活動(dòng)指標(biāo)檢測(cè) 魏氏法檢測(cè)ESR，散射比濁法檢測(cè)Hs-CRP。

2 結(jié)果

2.1臨床特征比較 AS活動(dòng)組、非活動(dòng)組和健康對(duì)照組年齡和性別差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，AS活動(dòng)組病程明顯長(zhǎng)于AS非活動(dòng)組(P<0.05)，AS活動(dòng)組中ESR、Hs-CRP水平均高于AS非活動(dòng)組(P<0.01)。見(jiàn)表1。

表1 臨床資料

2.2各組志愿者外周血CD4+CD25highCD127lowTreg、CD8+CD28-Treg、CD8+CD28+Tc細(xì)胞比例及CD8+CD28+/CD8+CD28-AS活動(dòng)組CD4+CD25highCD127lowTreg比例低于AS非活動(dòng)組和健康對(duì)照組(P<0.05)；但AS非活動(dòng)組和健康對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與健康對(duì)照組相比，AS活動(dòng)組和非活動(dòng)組CD8+CD28-Treg比例均顯著降低(P<0.05)，但AS活動(dòng)組與AS非活動(dòng)組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。AS活動(dòng)組CD8+CD28+Tc細(xì)胞比例和CD8+CD28+/CD8+CD28-明顯高于AS非活動(dòng)組和正常對(duì)照組(P<0.05)，且AS非活動(dòng)組CD8+CD28+/CD8+CD28-明顯高于健康對(duì)照組(P<0.05)，3組CD8+CD28+Tc細(xì)胞比例差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖1、表2。

圖1 各組CD4+CD25highCD127lowTreg、CD8+CD28-Treg及CD8+CD28+Tc細(xì)胞流式圖Fig.1 Diagram of CD4+CD25highCD127lowTreg,CD8+CD28-Treg,CD8+CD28+Tc cells of each group by flow cytometry

表2 各組志愿者外周血CD4+CD25highCD127lowTreg、CD8+CD28-Treg、CD8+CD28+Tc細(xì)胞比例和

2.3各組志愿者血清IL-2、IL-6、TNF-α、IFN-γ、IL-17A水平 與健康對(duì)照組相比，AS活動(dòng)組和非活動(dòng)組患者血清IL-6、TNF-α、IL-17A水平均顯著升高，且AS活動(dòng)組患者血清IL-6、IL-17A水平均高于AS非活動(dòng)組(P<0.05)。AS活動(dòng)組患者血清IFN-γ水平明顯高于AS非活動(dòng)組和健康對(duì)照組(P<0.05)；但AS非活動(dòng)組和健康對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。3組志愿者血清IL-2水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3。

表3 各組IL-2、IL-6、TNF-α、IFN-γ、IL-17A水平

2.4AS患者CD4+CD25highCD127lowTreg、CD8+CD28-Treg、CD8+CD28+Tc細(xì)胞比例和CD8+CD28+/CD8+CD28-與BASDAI、ESR、Hs-CRP水平的相關(guān)性分析 AS患者CD4+CD25highCD127lowTreg細(xì)胞比例與BASDAI、ESR和Hs-CRP呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.654、-0.517、-0.577，P<0.01)，CD8+CD28-Treg細(xì)胞比例與BASDAI、ESR、Hs-CRP水平無(wú)相關(guān)性(P>0.05)。CD8+CD28+Tc細(xì)胞比例和CD8+CD28+/CD8+CD28-與BASDAI呈正相關(guān)(r=0.276、0.246，P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 CD4+CD25highCD127lowTreg、CD8+CD28-Treg、CD8+CD28+Tc細(xì)胞和CD8+CD28+/CD8+CD28-與BASDAI、ESR、Hs-CRP的相關(guān)性分析

3 討論

AS是常見(jiàn)于青年男性的慢性、炎癥性自身免疫性疾病，以中軸脊柱、骶髂關(guān)節(jié)受累為主，伴有外周關(guān)節(jié)癥狀，嚴(yán)重者可發(fā)生脊柱畸形和關(guān)節(jié)強(qiáng)直[10]。目前AS的病因及發(fā)病機(jī)制尚未明確，但機(jī)體免疫功能異常在AS發(fā)病中的作用已得到認(rèn)可，尤其是T細(xì)胞的免疫功能異常。

Treg是一類控制體內(nèi)自身免疫反應(yīng)的T細(xì)胞亞群，按其來(lái)源可分為天然產(chǎn)生的自然調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(nTreg)和誘導(dǎo)產(chǎn)生的適應(yīng)性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(iTreg)，通過(guò)細(xì)胞間直接接觸或分泌抑制性細(xì)胞因子(IL-10、TGF-β)等途徑抑制Th細(xì)胞及抗原提呈細(xì)胞功能，減少炎癥細(xì)胞因子及抗體分泌，發(fā)揮免疫效應(yīng)[7]。根據(jù)免疫表型不同，Treg可分為CD4+CD25+、CD4+CD25highCD127low、CD4+CD25highFoxp3+、CD8+CD28-和NKT細(xì)胞。不同表型Treg細(xì)胞與多種疾病發(fā)生發(fā)展相關(guān)，表達(dá)差異較大，韋巍等[11]發(fā)現(xiàn)與健康對(duì)照者相比，Graves病患者外周血CD4+CD25+Treg表達(dá)明顯降低，CD8+CD28-Treg表達(dá)水平明顯升高。另有相關(guān)報(bào)道發(fā)現(xiàn)多發(fā)性硬化癥患者外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg水平顯著低于正常對(duì)照組，而CD8+CD28-Treg水平與健康對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[12]。目前對(duì)AS患者中不同表型Treg的研究鮮有報(bào)道。

本研究中發(fā)現(xiàn)AS活動(dòng)期患者外周血CD4+CD25highCD127lowTreg細(xì)胞水平較正常對(duì)照組明顯降低，且AS活動(dòng)期患者外周血CD4+CD25highCD127lowTreg細(xì)胞水平明顯低于AS非活動(dòng)期患者，隨著病情加重，CD4+CD25highCD127lowTreg比例逐漸降低。相關(guān)性分析顯示，CD4+CD25highCD127low與BASDAI、ESR、Hs-CRP均呈負(fù)相關(guān)，與既往研究結(jié)果一致[13,14]。提示CD4+CD125highCD127lowTreg細(xì)胞水平可能是反映AS患者病情活動(dòng)性和病情嚴(yán)重度的有效指標(biāo)之一。

CD28分子是一種由鏈間二硫鍵相連，以同源二聚體形式存在于T細(xì)胞表面的Ⅰ型糖蛋白，與抗原提呈細(xì)胞(APCs)表面B7家族分子(CD80、CD86)構(gòu)成一對(duì)重要的共刺激分子，為T細(xì)胞活化必需的第二信號(hào)[15,16]。根據(jù)細(xì)胞膜是否表達(dá)CD28分子，可將CD8+T細(xì)胞分為CD8+CD28+殺傷性T細(xì)胞(Tc細(xì)胞)和CD8+CD28-Treg細(xì)胞。CD8+CD28+Tc細(xì)胞可特異性識(shí)別抗原，執(zhí)行免疫殺傷作用。CD8+CD28-Treg細(xì)胞可通過(guò)上調(diào)APCs表面的抑制性受體(ILT3、ILT4)和下調(diào)共刺激分子(CD80、CD86)表達(dá)，阻止效應(yīng)性T細(xì)胞活化，發(fā)揮其免疫抑制功能[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，與健康對(duì)照組相比，AS活動(dòng)期和非活動(dòng)期患者外周血CD8+CD28-Treg細(xì)胞水平降低，而AS活動(dòng)組和非活動(dòng)組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與Tulunay等[18]在系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)中得出的結(jié)論相同。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)AS活動(dòng)期患者CD8+CD28+Tc和CD8+CD28+/CD8+CD28-水平均高于AS非活動(dòng)期患者和正常對(duì)照人群，且AS非活動(dòng)組CD8+CD28+/CD8+CD28-高于正常對(duì)照組。相關(guān)性分析顯示，CD8+CD28-Tc細(xì)胞與BASDAI、ESR、Hs-CRP無(wú)明顯相關(guān)，而CD8+CD28+Tc和CD8+CD28+/CD8+CD28-與BASDAI呈正相關(guān)。以上結(jié)果提示AS患者中CD8+CD28-Treg細(xì)胞比例降低，其對(duì)CD8+CD28+Tc細(xì)胞抑制作用減弱，使CD8+CD28+Tc細(xì)胞增殖、活化，二者的免疫平衡功能紊亂可能在該疾病發(fā)病過(guò)程中起重要作用。

初始CD4+T細(xì)胞在不同細(xì)胞因子作用下可分化為不同功能的Th細(xì)胞，包括Th1、Th2和Th17，Th1細(xì)胞主要分泌IL-2、IFN-γ、TNF-α等細(xì)胞因子，介導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)；Th2細(xì)胞主要分泌IL-6等，促進(jìn)B細(xì)胞活化，介導(dǎo)體液免疫反應(yīng)；Th17細(xì)胞分泌IL-17等炎癥因子，在炎癥疾病中發(fā)揮重要作用[19]。與健康對(duì)照組相比，AS活動(dòng)組和非活動(dòng)組患者血清炎癥因子IL-6、TNF-α、IL-17A表達(dá)水平顯著升高，且AS活動(dòng)組IL-6、IL-17A、IFN-γ高于AS非活動(dòng)組，推測(cè)Treg細(xì)胞數(shù)量減少導(dǎo)致其免疫抑制作用減弱，促Th細(xì)胞功能增強(qiáng)導(dǎo)致自身反應(yīng)性T、B淋巴細(xì)胞過(guò)度增殖，產(chǎn)生大量炎癥因子和自身抗體，機(jī)體維持免疫穩(wěn)定失調(diào)，引發(fā)自身免疫反應(yīng)。本研究針對(duì)AS患者中兩群不同表型Treg檢測(cè)結(jié)果不完全一致，同時(shí)，發(fā)現(xiàn)一些細(xì)胞因子在AS活動(dòng)組、非活動(dòng)組與健康對(duì)照組之間無(wú)顯著性差異，可能與本研究樣本量較小有關(guān)，有待增加病例數(shù)后進(jìn)一步研究；此外，CD4+CD25highCD127low及CD8+CD28-Treg細(xì)胞在維持免疫耐受中的作用機(jī)制可能不同，導(dǎo)致其作用部位及效應(yīng)差異。

綜上所述，與健康人群相比，AS患者外周血CD4+CD25highCD127lowTreg、CD8+CD28-Treg細(xì)胞比例均顯著降低，CD8+CD28+Tc細(xì)胞比例和IL-6、TNF-α、IFN-γ、IL-17A水平顯著升高。CD4+CD25highCD127lowTreg細(xì)胞比例與BASDAI、ESR和Hs-CRP水平呈負(fù)相關(guān)，表明AS患者體內(nèi)Treg細(xì)胞數(shù)量減少，炎癥細(xì)胞因子水平提高，在AS發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，但具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。