白術多糖對小鼠淋巴細胞的免疫調節作用①

徐 偉 方思佳 關 然 張岑容 胡松華

(浙江大學動物科學學院，杭州 310058)

中藥白術系菊科植物白術(AtractylodesmacrocephalaKoidz.)的干燥根莖，始載于《神農本草經》，列為上品，具有燥濕利水、補脾健胃、止汗、安胎等功效，主治脾虛泄瀉、食少肚脹、倦怠乏力、胎動不安等病癥。白術為常用大宗中藥材，據統計，2010年版《中國藥典》共收載113種含白術的中藥制劑，年需求量約為13 000噸。研究表明，白術的主要化學成分為揮發油、內酯及多糖，白術多糖具有抗氧化、抗腫瘤、降血糖及免疫調節等多種生物活性[1-6]。作為天然大分子物質，多糖對機體免疫系統具有重要調節作用，多糖類免疫調節劑已廣泛應用于醫療和保健食品行業[7]。作者所在實驗室前期研究發現，在奶牛乳房淋巴結部位注射白術多糖能降低其體細胞數量，緩解其乳腺感染癥狀，并初步證明其機制可能是其白術多糖對淋巴細胞的免疫調節作用[8-11]。本研究通過分析白術多糖聯合ConA或LPS對體外培養小鼠脾淋巴細胞增殖、細胞因子分泌、轉錄因子mRNA表達和淋巴細胞亞群等的影響，探討白術多糖調節淋巴細胞免疫應答的可能作用機制，為從細胞和分子層面理解白術多糖通過增強乳腺免疫功能治療奶牛乳房炎提供理論依據，對白術多糖作為免疫調節劑的開發與應用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1藥品與試劑 白術多糖由浙江大學中獸醫研究室制備，苯酚硫酸法檢測其總糖含量為95.66%，并經鱟試劑檢測確認不含內毒素[9]；改良型RPMI1640培養基(SH30809.01)、胎牛血清(fetal bovine serum，FBS，SV30087)購自美國Hyclone公司；四甲基偶氮唑藍(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT，M2128)、脂多糖(lipopolysaccharide，LPS，L2630)、刀豆蛋白A(Concanavallin A，ConA，L7647)購自美國Sigma公司；紅細胞裂解液(R1010)、Hank′s平衡鹽溶液(Hank′s balanced salt solution，HBSS，H1045)購自北京索萊寶科技有限公司；小鼠細胞因子IL-2(70-EK202)、IL-6(70-EK206)、IL-10(70-EK210)、TNF-α (70-EK282)ELISA試劑盒和IgG(70-EK271)ELISA試劑盒購自杭州聯科生物技術股份有限公司；青霉素-鏈霉素溶液(C0222)購自上海碧云天生物技術有限公司；FITC anti-mouse CD4(561828)、PE anti-Mouse CD8(561095)、APC anti-mouse CD3(561826)和PE anti-mouse CD19(561736)流式抗體購自美國BD公司；RNA提取試劑盒(RN28)購自北京艾德萊生物科技有限公司；反轉錄試劑盒(PrimeScriptTM RT Master Mix，RR036A)和熒光定量試劑盒(SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ，RR820A)購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.1.2實驗動物 6～8周齡雌性ICR小鼠，體質量18～20 g，購自上海史萊克實驗動物有限責任公司，飼養于IVC獨立送風飼養籠具，飼喂無菌飼料和飲水，(25±1)℃、(50±10)%濕度預飼養1周后開始實驗。

1.1.3儀器與設備 SW-CJ-2F型超凈工作臺購自蘇州凈化設備有限公司；MCO-15AC型二氧化碳培養箱購自日本SANYO公司；Multiskan FC型酶標儀購自賽默飛世爾(上海)儀器有限公司；5810R型臺式大容量高速冷凍離心機購自德國Eppendorf公司；VORTEX-5型渦旋混合器、QB-9002型微孔板快速振蕩器購自海門市其林貝爾儀器制造有限公司；T100TMThermal Cycler和CFX96 Touch PCR儀購自美國 Bio-Rad 公司；FACSVerse型流式細胞儀購自美國BD公司。

1.2方法

1.2.1小鼠脾淋巴細胞懸液制備 脫頸處死小鼠，75%乙醇中浸泡5 min，無菌分離脾臟，加HBSS研磨后200目濾網過濾。收集細胞，1 500 r/min離心5 min，棄上清，加入3 ml紅細胞裂解液，于冰上靜置3 min。1 500 r/min離心5 min，棄上清，收集細胞用PBS洗2遍后重懸于1640完全培養基(10% FBS+1%雙抗)，臺盼藍染色計數，活細胞數>95%時，調整細胞濃度至5×106個/ml。

1.2.2脾淋巴細胞增殖試驗 取1.2.1脾淋巴細胞懸液100 μl/孔加入96孔板，試驗組每孔加入50 μl ConA(10 μg/ml)或LPS(10 μg/ml)和50 μl不同濃度的白術多糖溶液(終濃度為12.5、25、50、100和200 μg/ml)，對照組每孔加入100 μl ConA(5 μg/ml)或LPS(5 μg/ml)，每組3個復孔。37℃、5%CO2培養44 h，每孔加入20 μl MTT(5 mg/ml)，繼續培養4 h，1 500 r/min離心8 min，棄上清，每孔加入150 μl DMSO，振蕩5 min充分溶解結晶，酶標儀檢測OD570值。

1.2.3細胞因子含量檢測 細胞鋪板同1.2.2，白術多糖終濃度為25、50和100 μg/ml。37℃、5%CO2培養48 h，10 000 r/min離心5 min，收集上清，按照ELISA試劑盒說明書檢測樣品中IL-2、IL-6、IL-10和TNF-α含量。

1.2.4IgG含量檢測 細胞鋪板同1.2.2，僅設LPS+白術多糖(終濃度為25、50和100 μg/ml)和LPS對照組，每組3個復孔，于37℃、5%CO2培養48 h，10 000 r/min離心5 min，收集上清，按照ELISA試劑盒說明書檢測樣品IgG含量。

1.2.5轉錄因子mRNA表達檢測 于24孔板中每孔加入1 ml細胞懸液，試驗組每孔加入500 μl ConA(10 μg/ml)或LPS(10 μg/ml)和500 μl不同濃度的白術多糖溶液(終濃度為25、50和100 μg/ml)，對照組每孔加入1 ml ConA(5 μg/ml)或LPS(5 μg/ml)，每組3個復孔。37℃、5%CO2培養24 h，收集細胞，按照試劑盒說明書提取總RNA并反轉錄為cDNA。熒光定量PCR反應體系與反應條件：采用20 μl體系，其中10 μl SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ，上下游引物(10 μmol/L)各0.8 μl，2 μl cDNA，6.4 μl RNase-free H2O，95℃(30 s)，95℃(5 s)，60℃(31 s)，40 個循環，2-ΔΔCt法計算。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列及擴增長度見表1。

表1 引物序列及產物長度

1.2.6淋巴細胞亞群檢測 于24孔板中每孔加入1 ml細胞懸液，試驗組每孔加入500 μl LPS(10 μg/ml)和500 μl白術多糖溶液(400 μg/ml)，對照組每孔加入1 ml LPS(5 μg/ml)。37℃、5%CO2培養48 h，收集細胞，分別用APC-CD3和PE-CD19或FITC-CD4和PE-CD8于4℃染色30 min，設置相應對照，PBS洗滌2次后流式細胞儀檢測。

2 結果

2.1白術多糖聯合ConA或LPS對脾淋巴細胞增殖的影響 不同濃度白術多糖聯合ConA作用于小鼠脾淋巴細胞時，其OD值均顯著高于ConA對照組(P<0.01)，且在12.5～100 μg/ml呈劑量依賴性，表明白術多糖能夠促進ConA誘導的小鼠脾臟T淋巴細胞的增殖，見圖1A。不同濃度的白術多糖聯合LPS作用于小鼠脾淋巴細胞時，其OD值均顯著低于LPS對照組(P<0.05)，表明白術多糖對LPS刺激的小鼠脾臟B淋巴細胞增殖具有抑制作用，見圖1B。

圖1 白術多糖聯合ConA或LPS對脾淋巴細胞增殖的影響Fig.1 Effects of RAMPtp combined with ConA or LPS on splenic lymphocyte proliferationNote:Compared with control,##.P<0.01;compared with ConA or LPS groups，*.P<0.05，**.P<0.01.

2.2白術多糖聯合ConA對脾淋巴細胞細胞因子水平的影響 不同濃度的白術多糖聯合ConA作用于小鼠脾淋巴細胞時，細胞因子IL-2、TNF-α、IL-6和IL-10水平均顯著高于ConA對照組(P<0.01)，表明白術多糖能夠促進ConA誘導的細胞因子IL-2、TNF-α、IL-6和IL-10分泌，見圖2。

圖2 白術多糖聯合ConA對細胞因子水平的影響Fig.2 Effects of RAMPtp combined with ConA on cytokine levelsNote: Compared with control,##.P<0.01;compared with ConA or LPS groups，**.P<0.01.

2.3白術多糖聯合LPS對脾淋巴細胞細胞因子和IgG的影響 不同濃度的白術多糖聯合LPS作用于小鼠脾淋巴細胞時，細胞因子TNF-α和IgG均顯著低于LPS對照組(P<0.01),且均呈劑量依賴性，表明白術多糖抑制LPS刺激的脾淋巴細胞分泌TNF-α和IgG，見圖3。

圖3 白術多糖聯合LPS對TNF-α和IgG水平的影響Fig.3 Effects of RAMPtp combined with LPS on TNF-α and IgG levelsNote: Compared with control,##.P<0.01;compared with ConA or LPS groups，**.P<0.01.

2.4白術多糖聯合ConA或LPS對脾淋巴細胞轉錄因子mRNA表達的影響 不同濃度的白術多糖聯合ConA作用于小鼠脾淋巴細胞時，轉錄因子T-bet和Gata3 mRNA表達呈劑量依賴性上調(P<0.01)，表明白術多糖能夠提高ConA誘導的脾淋巴細胞轉錄因子T-bet和Gata3 mRNA的表達水平，見圖4A；不同濃度的白術多糖聯合LPS作用于小鼠脾淋巴細胞時，轉錄因子NF-κB p65的mRNA表達呈劑量依賴性下調(P<0.01)，表明白術多糖可抑制LPS誘導的NF-κB p65的mRNA表達，見圖4B。

圖4 白術多糖聯合ConA或LPS對轉錄因子mRNA表達的影響Fig.4 Effects of RAMPtp combined with ConA or LPS on mRNA expressions of transcription factorsNote: Compared with control,##.P<0.01;compared with ConA or LPS groups,**.P<0.01.

2.5白術多糖聯合LPS對脾淋巴細胞亞群的影響 LPS處理后可降低CD3、CD4和CD8淋巴細胞亞群的比例，提高CD19細胞亞群的比例，與單獨使用LPS相比，當與白術多糖聯合使用時，CD3、CD4和CD8亞群的比例均有所提高，CD19亞群比例略微降低，表明白術多糖對T淋巴細胞具有免疫刺激作用，可調節其亞群比例的變化。見圖5。

圖5 白術多糖對LPS刺激的淋巴細胞亞群的影響Fig.5 Effects of RAMPtp on LPS-stimulated lympho-cyte subpopulation

3 討論

作為廣譜生物應答調節劑，多糖具有抗炎、抗菌、抗腫瘤、抗衰老、抗病毒及免疫調節等多種功能[12]。天然活性多糖在調節機體免疫功能的同時無明顯副作用，是理想的免疫調節劑。作為機體體液免疫和細胞免疫的中心，脾臟是T、B淋巴細胞定居的主要場所，因此脾淋巴細胞是研究機體免疫功能的常用細胞[13]。T、B淋巴細胞是參與機體免疫應答的主要免疫效應細胞，二者的體外增殖轉化能力是機體細胞免疫功能的重要體現。淋巴細胞增殖的評價依賴于選擇的絲裂原類型，ConA主要刺激T淋巴細胞增殖，LPS則主要誘導B淋巴細胞增殖[14]。不同來源的多糖對T、B淋巴細胞可能表現出不同的免疫刺激作用，如鐵皮石斛多糖和烏頭多糖在體外能夠同時促進ConA和LPS誘導的脾淋巴細胞增殖，表明其對T、B淋巴細胞均有促進作用，而云芝多糖CVP則選擇性作用于B淋巴細胞，對T淋巴細胞無免疫刺激作用[15-17]。本研究發現白術多糖能夠促進ConA誘導的T淋巴細胞增殖，但抑制LPS誘導的B淋巴細胞增殖，這表明白術多糖可能對脾淋巴細胞培養體系中的T、B淋巴細胞具有選擇性作用。

淋巴細胞介導的免疫反應與其分泌的細胞因子密切相關，Th1細胞主要分泌IL-2、IFN-γ和TNF-α等細胞因子，介導細胞免疫應答；Th2細胞主要分泌IL-4、IL-6和IL-10等細胞因子，介導體液免疫應答[18]。研究表明，杜仲多糖和荔枝多糖均能協同ConA促進Th1型細胞因子IFN-γ和Th2型細胞因子IL-4的分泌[19，20]。本研究發現，白術多糖和ConA聯合作用于脾淋巴細胞，細胞因子IL-2、TNF-α、IL-6和IL-10的分泌均顯著提高，表明白術多糖能活化T淋巴細胞并同時增強Th1和Th2型免疫反應，該結果在Th1轉錄因子T-bet(Th1型)和Gata3(Th2型)mRNA表達水平上得到進一步證實。免疫球蛋白的生成是B淋巴細胞活化的重要標志之一，研究表明黃芪多糖APS和云芝多糖CVP均能促進小鼠B淋巴細胞分泌免疫球蛋白[17,21]。本研究對白術多糖聯合LPS作用脾淋巴細胞后的TNF-α和IgG水平進行檢測，其含量均顯著降低，表明白術多糖能抑制LPS誘導的脾淋巴細胞培養體系中B淋巴細胞的活化，并進一步證明其機制可能是由于對NF-κB通路的抑制作用。CD4和CD8是T淋巴細胞的重要亞群，本研究發現白術多糖可一定程度減弱LPS誘導的CD3、CD4和CD8亞群比例的降低，表明白術多糖對T淋巴細胞具有活化作用，可調節其亞群比例變化。

綜上所述，白術多糖能促進ConA誘導的脾淋巴細胞轉化，但對LPS刺激的脾淋巴細胞轉化具有抑制作用，但其作用機制需進一步研究。