CXXC5對心房顫動大鼠心肌纖維化的影響及機制①

李小兵 王 軍 呂 瑛 黃建成 李紅英 李志杰 蘇振宇

(河北醫科大學第一醫院心臟外科,石家莊 050031)

心房顫動是潛在的心臟疾病，是常見的持續性快速型心律失常，患病率和死亡率均較高，男性的發病率高于女性，且隨著年齡的增長，心房顫動的患病率升高，隨著人口老齡化，心房顫動對人類健康造成嚴重威脅，心肌纖維化在心房結構重構中具有重要作用，是心房顫動發生的重要原因之一[1,2]。TGF-β是組織修復和纖維化發生的主要因素，TGF-β1可誘發心肌纖維化，Smads家族蛋白是TGF-β信號傳導通路中的關鍵傳導分子，TGF-β1/Smad信號通路是其最重要的傳導通路[3,4]。CXXC5具有信號轉導、細胞能量代謝、細胞凋亡、血管生成等生物學功能，在多種疾病發病中的作用越來越受到重視，在惡性腫瘤中作為一種潛在的腫瘤抑制因子，參與皮膚損傷后皮膚纖維化的形成，但其在心肌纖維化中的作用尚不清楚[5,6]。本文對CXXC5在心房顫動心肌纖維化中的表達及作用機制進行研究，探討其在心房顫動心肌纖維化中的作用。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 6～8周齡、雄性、清潔級、體質量210～220 g SD大鼠70只，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，許可證號：SCXK(滬)2007-0005。

1.1.2主要試劑 ISO、蘇木素、伊紅(美國Sigma公司)，BCA試劑盒、β-actin抗體、Ⅰ型膠原單克隆抗體、CXXC5單克隆抗體、TGF-β1單克隆抗體、Smad7單克隆抗體、HRP標記的山羊抗兔抗體等(美國BT公司)，Ⅰ型膠原、CXXC5、TGF-β1、Smad7(上海生物工程技術有限公司引物設計與合成)，CXXC5過表達質粒腺病毒載體和陰性對照質粒腺病毒載體(天津賽爾生物有限公司)。

1.2方法

1.2.1動物分組及建立心房顫動模型 將40只大鼠分為對照組、空白對照組、陰性對照組和過表達CXXC5組，每組10只。空白對照組、陰性對照組和過表達CXXC5組大鼠建立心房顫動心肌纖維化模型：大鼠腹部皮下注射ISO(5 mg/kg，1次/d，共14 d)，對照組腹部皮下注射等量生理鹽水；用藥后采用生物信號采集處理系統(MedLab-U/4C501H)描記大鼠心電圖，記錄標準Ⅱ導聯。對照組為標準Ⅱ導聯心電圖，建模大鼠出現標準Ⅱ導聯心房顫動心電圖(見圖1)，表示心房顫動模型建立成功(標準Ⅱ導聯心房顫動心電圖：①P波消失、代之以大小不等，形態各異的小F波，小F波的頻率350～600次/min；②心室率極其不規則，心室率100～160次/min；③QRS波群的形態正常，當心室率較快時，QRS波群可以增寬變形)。Ⅰ型膠原、CXXC5、TGF-β1、Smad7 mRNA水平測定 取100 g心肌組織在冰上勻漿器中剪碎，加入Trizol研磨混勻后提取心肌組織總RNA，采用熒光定量PCR(qPCR)測定各組大鼠心肌組織中Ⅰ型膠原。

1.2.2處理 造模后第2天，過表達CXXC5組大鼠經尾靜脈注射過表達CXXC5病毒5×109PFU，陰性對照組經尾靜脈注射等量陰性對照病毒，對照組和空白對照組經尾靜脈注射等量生理鹽水。注射后第7天處死大鼠，取心臟組織備用。

1.2.3HE染色 將石蠟包埋心肌組織切成5 μm切片，烤片30 min，脫蠟水化，蘇木素染色1 min，蒸餾水沖洗，鹽酸酒精分化10 s，蒸餾水沖洗，氨水返藍30 s，蒸餾水沖洗，伊紅染色20 s，酒精脫水，二甲苯透明，封片后顯微鏡下觀察染色情況。

1.2.4Masson染色 將石蠟標本切片烤片 30 min，脫蠟水化，蒸餾水沖洗，蘇木精染色10 min，蒸餾水沖洗，鹽酸酒精分化5 s，蒸餾水沖洗，Masson麗春紅酸性復紅液染色10 min，蒸餾水沖洗，磷鉬酸溶液染色，甲苯胺藍染色10 min，蒸餾水沖洗，顯微鏡下觀察染色情況。

1.2.5膠原容積分數(CVF)測定 Masson染色后膠原纖維被染成紫藍色，纖維素和心肌細胞被染成紫紅色，應用IBAS Ⅱ圖像軟件分析系統，測定CVF，CVF=膠原面積/總面積。

圖1 兩組大鼠Ⅱ導聯心電圖Fig.1 Ⅱ lead ECG of rat in two groups

1.2.6大鼠心肌組織中Ⅰ型膠原、CXXC5、TGF-β1、Smad7 mRNA水平測定 取100 g心肌組織在冰上勻漿器中剪碎，加入Trizol研磨混勻后提取心肌組織總RNA，采用熒光定量PCR(qPCR)測定各組大鼠心肌組織中Ⅰ型膠原(上游引物：5′-GATCTGTATCTGCCACAATG-3′，下游引物：5′-CAGAAAGCACAGCACTCGCC-3′)、CXXC5(上游引物：5′-GTGGACGGCTCGCGCAGTTG-3′，下游引物：5′-CACACGACCACTGACATTGC-3′)、TGF-β1(上游引物：5′-TGGCGTTAGCTTCGTAAGG-3′，5′-GTGTTGACCG-TTTGCAG-3′)、Smad7(上游引物：5′-AGGCTGTACTGTATCCAAGA-3′，下游引物：5′-GAATTAATGAA-GATAGGGTA-3′) mRNA水平，PCR反應條件為：95℃ 10 min；95℃ 20 s、62℃ 30 s、72℃ 15 s，共40個循環；72℃ 5 min。以U6(上游引物：5′-CTCGCTTGGCCAGCACA-3′，下游引物：5′-AACGCTTGAGGAATTTGCGT-3′)為內參，大鼠心肌組織中Ⅰ型膠原、CXXC5、TGF-β1、Smad7 mRNA相對表達量采用2-ΔΔCt表示。

1.2.7心肌組織中 Ⅰ 型膠原、CXXC5、TGF-β1、Smad7蛋白水平測定 將各組大鼠心肌組織放入EP管中、加入蛋白裂解液裂解，13 000 r/min離心15 min后取上清，采用BCA法測定心肌組織蛋白濃度，采用Western blot法測定大鼠心肌組織中Ⅰ型膠原、CXXC5、TGF-β1、Smad7蛋白水平，經凝膠電泳、轉膜、脫脂奶粉封閉，加入一抗( Ⅰ 型膠原單克隆抗體稀釋比例1∶1 000、CXXC5單克隆抗體稀釋比例1∶1 000、TGF-β1單克隆抗體稀釋比例1∶1 000、Smad7單克隆抗體稀釋比例1∶500)過夜孵育，以β-actin為內參照，加入HRP標記的山羊抗兔抗體(1∶3 000)孵育1 h,ECL顯影。目標蛋白的相對表達量=目標蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值。

2 結果

2.1各組大鼠心肌HE染色 HE染色顯示心肌細胞被染成紫紅色，心肌細胞核被染成紫藍色。對照組大鼠心肌細胞橫紋清晰、細胞排列整齊，細胞大小正常；空白對照組和陰性對照組大鼠心肌細胞顯著增大、排列紊亂，間質增多，有明顯成纖維細胞增生；過表達CXXC5組大鼠心肌細胞排列稍紊亂，間質稍增多，有少量成纖維細胞增生，見圖2(圖中箭頭所示為成纖維細胞)。

2.2心房顫動心肌纖維化大鼠心肌Masson染色 Masson染色顯示心肌間質膠原纖維呈紫藍色，心肌細胞呈紫紅色，細胞核呈黑色。對照組心肌細胞排列整齊、膠原纖維含量少，細胞大小正常；空白對照組和陰性對照組大鼠心肌細胞排列紊亂，間質膠原纖維增多，心肌纖維化嚴重；過表達CXXC5組心肌細胞排列稍紊亂，有少量膠原沉積。與對照組相比，其他三組大鼠CVF升高(P<0.05)，與空白對照組和陰性對照組相比，過表達CXXC5組大鼠CVF降低(P<0.05)，空白對照組和陰性對照組大鼠CVF差異無統計學意義(P>0.05)。見圖3、表1(圖中箭頭所示為膠原沉積)。

2.3過表達CXXC5對心房顫動心肌纖維化大鼠心肌組織中 Ⅰ 型膠原、CXXC5、TGF-β1、Smad7 mRNA水平的影響 與對照組相比，其他3組大鼠心肌組織中CXXC5、Smad7 mRNA水平降低(P<0.05)，TGF-β1 mRNA水平升高(P<0.05)；與空白對照組和陰性對照組相比，過表達CXXC5組大鼠心肌組織中CXXC5、Smad7 mRNA水平升高(P<0.05)，TGF-β1 mRNA水平降低(P<0.05)；空白對照組和陰性對照組大鼠心肌組織中CXXC5、TGF-β1、Smad7 mRNA水平比較差異無統計學意義(P>0.05)。見圖4。

圖2 各組大鼠心肌組織HE染色(×200)Fig.2 HE staining of myocardial tissue in each group(×200)Note:A.Control group；B.Blank control group；C.Negative control group；D.Over-expressed CXXC5 group.

圖3 各組大鼠心肌組織Masson染色(×200)Fig.3 Masson staining of myocardial tissues of rats in each group(×200)Note:A.Control group；B.Blank control group；C.Negative control group；D.Over-expressed CXXC5 group.

表1 各組大鼠CVF比較

圖4 各組大鼠心肌組織中Ⅰ型膠原、CXXC5、TGF-β1、Smad7 mRNA水平Fig.4 Type Ⅰ collagen,CXXC5,TGF-β1 and Smad7 mRNA levels in each groups of rat myocardial tissuesNote:Compared with control group,*.P<0.05；compared with blank control group,#.P<0.05；compared with negative control group,△.P<0.05.

2.4過表達CXXC5對心房顫動心肌纖維化大鼠心肌組織中Ⅰ型膠原、CXXC5、TGF-β1、 Smad7蛋白水平的影響 與對照組相比，其他3組大鼠心肌組織中CXXC5、Smad7蛋白水平升高(P<0.05)，TGF-β1蛋白水平降低(P<0.05)；與空白對照組和陰性對照組相比，過表達CXXC5組大鼠心肌組織中CXXC5、Smad7蛋白水平降低(P<0.05)，TGF-β1蛋白水平升高(P<0.05)；空白對照組和陰性對照組大鼠心肌組織中CXXC5、TGF-β1、Smad7蛋白水平比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表2、圖5。

表2 各組大鼠心肌組織中Ⅰ型膠原、CXXC5、TGF-β1、Smad7蛋白水平比較

圖5 Western blot檢測各組大鼠心肌組織中Ⅰ型膠原、CXXC5、TGF-β1、Smad7蛋白表達Fig.5 Western blot analysis of type I collagen，CXXC5,TGF-β1 and Smad7 proteins in each group of rat myocardial tissueNote:1,2.Control group；3,4.Blank control group；5,6.Negative control group；7,8.Over-expressed CXXC5 group.

3 討論

心房顫動的發病機制比較復雜，目前認為心房顫動是心房重構、異常鈣離子電流、自主神經系統改變共同作用的結果，其中心房重構是心房顫動的重要環節[7]；心房重構包括心房電重構和心房結構重構，心房電重構是由于縫隙連接蛋白功能及數量和心房肌離子通道的改變所引起，心房電重構可引起心房肌有效不應期縮短、不應期離散度增加、傳遞受損、觸發活動增多、傳導各向異性增加，有利于局部多子波和微折返的形成[8]；心房結構重構的顯著特征為心房纖維化，正常心肌細胞被膠原纖維化包繞劃分，從而破壞心肌細胞之間的傳導連續性，引起傳導異質性增加、傳導速度減慢，為折返環的形成和單項傳導阻滯提供了病理基礎[9]。心房顫動還可導致心房擴大、心房收縮力下降，有利于心房顫動的維持發展。臨床上抗心律失常藥主要針對心房電重構，因此治療效果有限；心房纖維化作為心房顫動最危險的因素，探討其發病機制對阻斷心房結構重構具有重要意義，可為心房顫動的預防和治療提供新的思路。

TGF-β為一種多功能細胞因子，在纖維化發生中具有重要作用，是關鍵的促進纖維化因子，對沉積細胞外基質具有強烈的促進作用[10]；TGF-β1是TGF-β的亞型之一，可促進心肌細胞中Ⅰ型膠原纖維蛋白的合成和分泌，從而誘導心肌纖維化的發生[11]。Smads蛋白家族是TGF-β信號傳導的介導子，TGF-β1發揮生物學作用的主要通路為TGF-β1/Smad信號通路，Smad7是該信號通路的抑制性蛋白，可以和Smad2和Smad3競爭性結合，阻止Smad2和Smad3磷酸化激活，從而對TGF-β1/Smad信號通路發揮抑制作用[12]；降低心肌組織中Smad7表達可促進心肌纖維化，Smad7過表達可促進心肌纖維化[13]。

CXXC5為一種新發現的具有CXXC型鋅指結構域的蛋白質，唯一人類5q31染色體上，在心臟、肝臟、肺臟、前列腺、卵巢、粒細胞等不同組織和細胞中具有不同水平的表達，主要定位在細胞質和細胞核中[14,15]。CXXC5具有廣泛的生物學功能，在成纖維細胞、成骨細胞、心肌細胞、骨骼肌細胞、神經干細胞、粒細胞等細胞的遷移和分化中發揮重要作用[16,17]；在細胞能量代謝、血管生成、細胞凋亡、信號轉導中也具有重要作用[18,19]。CXXC5在多種疾病中的作用越來越受到關注，目前研究比較多的為惡性腫瘤，CXXC5在惡性腫瘤中作為一種潛在的腫瘤抑制因子[20]。CXXC5也參與纖維化的過程，在皮膚損傷修復過程中，CXXC5參與皮膚纖維化的形成，過表達CXXC5可降低α-平滑肌肌動蛋白、膠原蛋白Ⅰ等的水平，敲低CXXC5可使皮膚傷口膠原合成增加，促進傷口愈合。

CXXC5在心肌纖維化中的作用尚不清楚。本研究發現在心房顫動心肌纖維化大鼠心肌組織中CXXC5水平降低，考慮CXXC5可能參與心房顫動心肌纖維化的過程；且心房顫動心肌纖維化心肌組織中Smad7水平降低，Ⅰ型膠原、TGF-β1水平升高。Ⅰ型膠原在心房纖維化時合成和分泌增加，Ⅰ型膠原含量可反映心房纖維化程度。因此由本研究結果分析心房顫動的纖維化和心房重構與TGF-β1/Smad7抑制性信號通路減弱有關。本研究對心房顫動心肌纖維化大鼠給予過表達CXXC5處理，發現過表達CXXC5可升高心房顫動心肌纖維化大鼠心肌組織中CXXC5和Smad7水平，降低Ⅰ型膠原、TGF-β1水平，分析CXXC5可能通過TGF-β1/Smad7信號通路進而抑制心房顫動心肌纖維化的過程。

綜上所述，CXXC5水平下降可能是誘導心房顫動心肌纖維化的潛在機制，過表達CXXC5可能通過抑制TGF-β1/Smad7信號通路進而抑制心房顫動心肌纖維化，CXXC5有望成為心房顫動心肌纖維化的潛在靶點。