miR-138靶向OX40L對實驗性自身免疫性腦脊髓炎幼鼠的作用機制研究①

趙秀英 符之富 符彬莎 李文華

(海南省人民醫院，海南醫學院附屬海南醫院，海口 570311)

自身免疫性腦炎是兒童較常見的腦部疾病。這種腦炎由多種免疫介導，主要癥狀包括精神障礙、行為異常、記憶衰退、癲癇等癥狀，嚴重影響兒童健康，通常需要多學科聯合治療[1]。研究顯示，T細胞對全身免疫穩態的維持至關重要[2]，然而經過十多年的研究，對自身免疫應答過程中T細胞的分子應答機制尚未完全明確。有研究顯示，microRNA(miRNA)是生物體內的關鍵基因，可調節T細胞的增殖和凋亡等生物學行為，這說明miRNA對T細胞介導的免疫穩態至關重要[3,4]。研究顯示，miR-138在大腦中富集，可調節多種生物學過程，如小鼠海馬神經元中樹突棘的形態發生；也有研究表明miR-138在癌癥中具有多方面的作用，但miR-138與免疫系統間的互作機制尚不清楚[5-8]。因此，本研究將通過構建實驗性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)小鼠模型，獲取自身免疫性腦炎中的關鍵細胞，在細胞水平探究miR-138對T細胞增殖和凋亡的影響及分子機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 健康SPF級C57BL/6小鼠購于廣東省醫學實驗動物中心，體質量15～18 g，5周齡，雌雄各半。

1.1.2主要試劑 MOG35-55多肽購于上海翱博生物公司；含卡介苗弗氏完全免疫佐劑(FCA)購于上海遠慕生物科技有限公司；百日咳結核桿菌毒素PTX購于美國Sigma公司；percoll分離液、FACS緩沖液購于上海穎心實驗室設備有限公司；小鼠FC Block抗體、CD45-PE抗體、TLR3抗體、TLR4抗體及FIZZ-1抗體購于北京百奧萊博科技有限公司；Lipofectamine 2000試劑盒購于美國Invitrogen公司；PrimeScript miRNA cDNA試劑盒購于大連寶生物工程有限公司；TRIzol試劑盒、CD4+T細胞陰性分選免疫磁珠試劑盒、BCA試劑盒、ECL試劑盒及定點誘變試劑盒購于北京賽因坦科技有限公司。

1.2方法

1.2.1構建EAE小鼠模型 取40只C57BL/6小鼠，隨機挑選15只作為對照組，其余25只用于構建EAE小鼠模型。將人工合成的MOG35-55多肽(200 μg)溶解于200 μl PBS緩沖液，與200 μl含4 mg/ml卡介苗的FCA在真空中完全混勻，30 min后制備完成。同時，將200 μl PBS緩沖液與等量FCA溶液乳化，用于對照組小鼠。將上述制備好的2種混合乳液在第0天分別注射于小鼠雙側背部脊椎旁分4點皮下，在各組小鼠免疫后的第0天和第2天腹腔注射200 ng PTX，至此EAE小鼠模型構建完成。

1.2.2EAE小鼠模型神經功能評分 本研究中EAE小鼠模型的神經功能評分按照6分法進行，具體評分規則如下：0分：無明顯疾病癥狀；0.5分：尾巴部分無力，出現拖尾癥狀；1.0分：尾巴完全癱瘓，尾巴變軟，完全無力；2.0分：雙后肢無力；2.5分：后肢部分癱瘓，單后肢完全癱瘓；3.0分：雙后肢完全癱瘓，被動翻身后不能自行恢復；3.5分：雙后肢完全癱瘓，前置部分癱瘓；4.0分：四肢完全癱瘓；5.0分：瀕死狀態；6.0分：死亡。

1.2.3分離活化小膠質細胞 取處于發病高峰期的EAE組小鼠及同時期的對照組小鼠各5只，將小鼠窒息處死后在無菌條件下獲取各組小鼠的腦組織及脊髓。在室溫條件下將腦組織與脊髓置于含0.25%胰酶及1 mmol/L的EDTA混合液中消化，15 min 后用含10%胎牛血清的IMDM培養基終止消化。消化后的細胞800 g離心10 min，收集離心后的細胞沉淀并使用percoll分離液分離，900 g離心 7 min 后再次收集細胞沉淀。收集的細胞沉淀置于400 μl的FACS緩沖液中重懸，加入FC Block冰浴 30 min 后800 g離心5 min，再次以50 μl的FACS重懸，調整細胞密度為1×106個/ml后加入抗CD11b-FITC及抗CD45-PE流式抗體，避光冰浴30 min 后800 g離心5 min棄上清，用FACS緩沖液重懸后使用流式細胞儀分選小膠質細胞。

1.2.4免疫熒光染色 取處于對數生長期的各組細胞，以1.5×105個/孔的密度接種于帶有滅菌蓋玻片的6孔板中，接種后于37℃、5%CO2的恒溫培養箱中孵育24 h。去除蓋玻片后按照二步雙染色法處理，在熒光顯微鏡下觀察TLR3、TLR4及FIZZ-1的表達。

1.2.5細胞轉染 將各組處于對數生長期的細胞接種至含RPMI1640培養基的6孔板中，在37℃、5%CO2的恒溫培養箱中孵育72 h，按照Lipofectamine 2000試劑盒說明書將合成的脂質體轉染至各組細胞內，12 h后將各組細胞轉移至含完全培養基的6孔板中保存以用于后續實驗。

1.2.6RT-qPCR實驗 使用TRIzol試劑盒提取各組細胞內的總RNA，使用PrimeScript miRNA cDNA試劑盒合成cDNA，使用Step OnePlusTM實時PCR系統進行反應，反應條件為95℃ 5 min，95℃ 20 s，60℃ 30 s，共進行40個循環。U6及GAPDH分別作為miR-138和OX40L mRNA的內參，使用2-ΔΔCt法計算miR-138及OX40L mRNA的相對表達水平。引物序列如下：miR-138(F：5′-GTATTGACTAGATTAATCACTGT-3′；R：5′-TCTCCGCATCACCACAGAA-G-3′)，OX40L mRNA(F：5′-CCTACATCTGCCTGC-ACTTCTC-3′；R：5′-TGATGACTGAGTTGTTCTGCA-CC-3′)，U6(F：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′；R：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′)，GAPDH(F：5′-GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG-3′；R:5′-ACCACCC-TGTTGCTGTAGCCAA-3′)。

1.2.7CD4+T細胞的分離 取對照組小鼠5只，在無菌條件下取其外周血，按照小鼠CD4+T細胞陰性分選免疫磁珠試劑盒說明書分離CD4+T細胞，FACS檢測獲取的CD4+T細胞純度。

1.2.8CD4+T細胞增殖活性檢測 取處于對數生長期的CD4+T細胞及活化小膠質細胞，經胰酶消化后制備成細胞懸液，在37℃、5%CO2的恒溫培養箱中間接共培養96 h，每間隔24 h使用MTT比色法檢測CD4+T細胞的增殖活性。

1.2.9細胞凋亡檢測 自CD4+T細胞及活化小膠質細胞間接共培養后，每24 h收集懸浮的T細胞，按照Annexin V-FITC-PI試劑盒說明書檢測T細胞的凋亡水平。

1.2.10Western blot 在各組細胞按照1.2.5中的方法轉染48 h后，用RIPA裂解緩沖液提取小膠質細胞內總蛋白，用BCA試劑盒檢測蛋白濃度。取適量蛋白質在SDS-PAGE凝膠中分離，并轉移至PVDF膜。用含5%脫脂奶粉的緩沖液封閉2 h后在蛋白質樣品中加入鼠抗人OX40L抗體(1∶1 000)或GAPDH單克隆抗體(1∶2 000)在4℃條件下孵育過夜。加入相應的山羊抗兔二抗(1∶2 000)后在室溫下孵育1 h，使用ECL試劑盒顯影后拍照分析。

1.2.11雙熒光素酶報告基因實驗 使用定點誘變試劑盒誘變產生OX40L-MUT，并將其與OX40L-WT克隆至pMIR-REPORT熒光素酶報告載體中。使用Lipofectamine 2000試劑盒將pMIR-OX40L-WT、pMIR-OX40L-MUT、miR-NC及miR-138 mimics共轉染至小膠質細胞內，在37℃、5%CO2的條件下將轉染后的細胞置于含10%FBS的DMEM培養基中培養48 h，使用雙熒光素酶報告基因系統分析相對熒光素酶活性。

1.3統計學處理 采用SPSS21.0軟件分析數據，t檢驗用于分析兩組間差異，單因素方差分析用于比較多組間差異，以P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1EAE模型的鑒定 將40只小鼠隨機分為對照組(15只)和EAE組(25只)。EAE組小鼠自免疫后的5 d后開始發病，大部分表現為尾部無力，后肢無力等癥狀。在16 d左右進入發病高峰期，小鼠均出現四肢癱瘓甚至大小便失禁等癥狀。在25 d左右時進入緩解期，在此期間內EAE組小鼠體重逐漸增加，癥狀有不同程度的緩解。對照組小鼠在此期間內體重增加正常，未出現不良癥狀。EAE組與對照組小鼠體重及神經功能評分變化如圖1，小鼠發病情況見表1。

圖1 EAE小鼠模型鑒定Fig.1 Identification of EAE mouse modelNote:A.Changes in body weight of mice；B.Changes of neurological function scores in mice.

表1 小鼠發病情況對照表

2.2小膠質細胞的分選與鑒定 經抗體標記處理后的單核細胞利用流式細胞儀分選，結果顯示EAE組小鼠中小膠質細胞的活化比例為21%，對照組小鼠小膠質細胞的活化比例為11%，符合預期結果，見圖2A。免疫熒光實驗結果顯示，EAE組活化小膠質細胞TLR3、TLR4及活化小膠質細胞特異性標志物FIZZ-1的表達相較于對照組顯著增加，見圖2B。

圖2 小膠質細胞的分選與鑒定Fig.2 Sorting and identification of microgliaNote:A.Flow cytometry sorting microglial chart；B.TLR3,TLR4 and FIZZ-1 immunofluorescence staining results.

2.3活化小膠質細胞內miR-138的表達水平 RT-qPCR檢測結果顯示，miR-138在EAE組小鼠模型腦組織中的表達水平顯著下調(P<0.05，圖3A)，同時，在分離的EAE組小鼠活化小膠質細胞內miR-138的表達水平也顯著下調(P<0.05，圖3B)，因此后續實驗選擇EAE組小鼠活化小膠質細胞(簡稱活化小膠質細胞)進行。RT-qPCR結果顯示，轉染miR-138 mimics后活化小膠質細胞內miR-138表達水平較轉染miR-NC的細胞顯著上升(P<0.05，圖3C)。將轉染miR-NC或miR-138 mimics的活化小膠質細胞與T細胞共培養，以MTT比色法檢測T細胞增殖，結果顯示，轉染miR-138 mimics的活化小膠質細胞與T細胞共培養會顯著抑制T細胞的增殖(P<0.05，圖3D)。凋亡結果顯示，轉染miR-138 mimics的活化小膠質細胞會顯著促進T細胞的凋亡(P<0.01，圖3E)。

圖3 miR-138在活化小膠質細胞內低表達Fig.3 Low expression of miR-138 in activated microgliaNote:A.miR-138 expression in mouse brain tissue；B.miR-138 expression in microglia；C.Transfection efficiency test；D.MTT colorimetric method to detect T cell proliferation；E.Flow cytometry to detect T cell apoptosis.#.P<0.05 vs Control group；*.P<0.05，**.P<0.01 vs miR-NC group.

2.4OX40L是miR-138的下游靶基因 生物信息學數據庫預測結果顯示，OX40L蛋白是miR-138的下游靶基因，結合位點見圖4A。雙熒光素酶報告基因實驗顯示，OX40L-WT組中轉染miR-138 mimics的熒光素酶活性顯著降低(P<0.01)，且OX40L-MUT組中轉染miR-138 mimics對熒光素酶活性基本無影響(圖4B)。此外，Western blot結果表明，轉染miR-138 mimics后會顯著抑制活化小膠質細胞OX40L的表達(P<0.01)，RT-qPCR檢測也顯示過表達miR-138會抑制活化小膠質細胞OX40L mRNA的表達(P<0.001，圖4C、D)。

圖4 OX40L為miR-138的下游靶基因Fig.4 OX40L is downstream target gene of miR-138Note:A.Binding site of miR-138 and OX40L；B.Dual luciferase reporter gene test；C.Western blot detection of OX40L protein expression；D.RT-qPCR detection of OX40L mRNA protein expression.**.P<0.01,***.P<0.001 vs miR-NC group.

2.5小膠質細胞內miR-138/OX40L分子軸調控T細胞的增殖與凋亡 RT-qPCR結果顯示，轉染miR-138 mimics會顯著上調其在活化小膠質細胞內的表達(P<0.01，圖5A)。轉染si-OX40L或pc-OX40L會顯著下調或上調OX40L mRNA在活化小膠質細胞內的表達(P<0.01)，Western blot實驗結果與RT-qPCR結果一致，且同時過表達miR-138和OX40L并未對活化小膠質細胞內OX40L的表達量產生顯著影響，圖5B、C。MTT檢測結果顯示，敲低活化小膠質細胞內OX40L的表達會顯著抑制T細胞的增殖(P<0.05)，相反，過表達OX40L會顯著促進T細胞的增殖(P<0.05)，但同時過表達活化小膠質細胞內miR-138和OX40L并未對T細胞的增殖產生顯著影響(P<0.05，圖5D)。凋亡結果顯示，敲低活化小膠質細胞內OX40L的表達會促進T細胞凋亡(P<0.001)，過表達OX40L則會抑制T細胞凋亡(P<0.001)，同時過表達活化小膠質細胞內miR-138和OX40L并未對T細胞的凋亡產生影響(圖5E)。

圖5 小膠質細胞內miR-138/OX40L分子軸對T細胞的增殖與凋亡的影響Fig.5 Effect of miR-138/OX40L molecular axis in microglia on proliferation and apoptosis of T cellsNote:A，B.Transfection efficiency test；C.MTT colorimetric method to detect T cell proliferation；D.Western blot detection of OX40L protein expression；E.Flow cytometry to detect T cell apoptosis.##.P<0.01 vs miR-NC group；*.P<0.05，**.P<0.01，***.P<0.001 vs Control group.

3 討論

兒童自身免疫性腦炎系自身免疫性反應導致的中樞神經系統性疾病，是由于神經元蛋白影響神經遞質傳遞及興奮性的自身免疫性抗體所致。臨床中以抗N-甲基-D-天門冬氨酸受體腦炎和自身免疫性邊緣葉腦炎最為常見，其中抗N-甲基-D-天門冬氨酸受體腦炎約占所有病例的80%以上[9]。小膠質細胞是中樞神經系統內具有免疫活性的細胞，是中樞神經系統微環境變化檢測最敏感的指標之一[10]。在正常中樞神經系統內，小膠質細胞一直處于靜止狀態，持續監測周圍環境變化。當中樞神經系統受到外界刺激后，活化的小膠質細胞會分泌一些重要的免疫因子，在疾病中發揮重要作用。研究顯示，小膠質細胞的活化發生在自身免疫性腦炎的發病早期[11]，且小鼠的自身免疫性腦炎通過T細胞誘導，結合二者在時間與空間上的聯系，筆者推測小膠質細胞與T細胞之間存在一定的互作。

miRNA是一類內源性非編碼RNA，可以與mRNA的3′非編碼區結合，在轉錄后影響靶基因的翻譯與表達。miR-138是中樞神經系統內重要的調節因子，Ren等[12]研究顯示，miR-138通過MLK3/JNK/MAPK信號通路抑制小鼠小膠質細胞的凋亡。本研究發現，miR-138在EAE組小膠質細胞內的水平顯著下調，且過表達小膠質細胞內miR-138的表達會顯著影響T細胞的增殖活性和凋亡水平，結果表明miR-138在自身免疫性腦炎的過程中發揮重要作用，且證實了筆者的前期推測。免疫共刺激分子OX40及其配體(OX40 ligand，OX40L)與T細胞的凋亡、增殖、細胞因子的表達密切相關[13]。Wang等[14]研究發現，OX40L在小膠質細胞內的表達水平對維持T細胞的增殖及多種因子的分泌提供了分子基礎。生物信息學數據庫預測結果顯示，OX40L與miR-138在3′非翻譯區有部分互補結合序列，并通過實驗證實OX40L是miR-138的下游靶基因。此外，過表達OX40L在小膠質細胞內的表達會顯著促進T細胞的增殖并抑制凋亡，這與Wang等[14]研究結果一致。同時過表達OX40L與miR-138在小膠質細胞內的表達對T細胞的增殖與凋亡并未產生顯著影響。

通過上述研究發現，EAE會導致小膠質細胞活化并下調miR-138表達，同時通過miR-138/OX40L分子軸上調OX40L在小膠質細胞內的表達，進而影響T細胞的增殖和凋亡，可能對EAE的治療產生一定效果。