丹參酮ⅡA減輕膿毒癥大鼠急性肝腎損傷①

陳智陽 黃江山 徐燕軍 林美英 鄒巧梅 李彩榮

(廈門大學附屬第一醫院思明分院檢驗科,廈門 361003)

膿毒癥是嚴重創傷、休克、感染和重大外科手術的常見并發癥，是一種高死亡率的危及生命的疾病[1]。盡管對膿毒癥的病理生理學了解有了很大的進步，但其治療仍然局限于抗生素、積極的液體復蘇、血管加壓素給藥和支持治療，患者預后較差，死亡率較高[2]。因此，探索新的治療方法十分必要。丹參酮ⅡA(Tanshinone ⅡA)是丹參的主要活性成分之一(結構如圖1所示),具有抗氧化、抗菌、抗炎、類激素、神經保護等作用，已被用于治療心血管疾病、腫瘤、糖尿病、肝病等[3,4]。已有研究表明丹參酮ⅡA通過抑制高遷移率族蛋白1對膿毒癥小鼠具有保護作用[5]。但丹參酮ⅡA對膿毒癥治療作用尚未完全闡明，本文旨在研究丹參酮ⅡA對膿毒癥大鼠急性肝腎損傷的治療作用。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 60只雄性SD大鼠購自長沙市天勤生物技術有限公司，雄性，體質量(205±20)g，常規飼養7 d。

圖1 丹參酮ⅡA化學結構Fig.1 Chemical structure of Tanshinone ⅡA

1.1.2藥物和儀器 丹參酮ⅡA購自美國Sigma-Aldrich(T4952)，純度≥97%。谷丙轉氨酶試劑盒(C009-2-1)、谷草轉氨酶試劑盒(C010-2-1)購自中國南京建城生物工程研究所；HE染色試劑盒(C0105)、TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(C1091)購自碧云天生物技術研究所；抗體IL-6(ab100712)、TNF-α(ab208348)、IL-1β(ab100704)ELISA試劑盒購自美國Abcam公司；熒光顯微鏡(DM2700)購自德國徠卡公司；酶標儀(FLUOstar Omega)購自德國BMG公司；全自動生化分析儀(LABOSPECT 008 AS)購自日本HITACHI公司。

1.2方法

1.2.1動物模型建立與分組 全部大鼠用10%水合氯醛溶液(350 mg/kg)麻醉，進行中線剖腹手術，將大鼠隨機分為4組，每組15只：①假手術組(CTRL)：取出盲腸進行暴露后放回腹腔，縫合切口;②盲腸結扎穿孔模型組(CLP):取出盲腸后，在盲腸根部約1/3處用4號手術絲線進行結扎，再用針輕輕刺破結扎部位遠端盲腸2次，2次穿孔相距3 cm 左右，再從穿孔處擠出米粒大小糞便，將盲腸放回腹腔，縫合切口[6]；③利奈唑胺模型組(LNZ)：處理方式同CLP組，處理完畢后腹腔注射25 mg/kg利奈唑胺[7]；④丹參酮 Ⅱ A模型組(TAN):處理方式同CLP組，處理完畢后腹腔注射100 mg/kg丹參酮 Ⅱ A[8]。造模96 h后處死大鼠，采集樣本進行后續實驗。

1.2.2HE染色 取大鼠肝腎組織用10%福爾馬林溶液固定48 h，石蠟包埋切片，用蘇木精-伊紅進行染色，在熒光顯微鏡下觀測并拍片。

1.2.3TUNEL染色 將肝腎組織石蠟切片脫蠟處理，滴加20 μg/ml不含DNase的蛋白酶K，20～37℃作用20 min，用PBS洗滌3次，加入50 μl TUNEL檢測液，37℃避光孵育60 min，用PBS洗滌1次，滴加0.2 ml標記反應終止液，室溫孵育10 min后用PBS洗滌3次，繼續在樣品上加50 μl Streptavidin-HRP工作液，室溫孵育30 min后用PBS洗滌3次，最后滴加0.3 ml DAB顯色液后在熒光顯微鏡下觀測。

1.2.4肝功能指標 根據試劑盒說明書，用酶標儀測定大鼠肝組織谷草轉氨酶(AST)、谷丙轉氨酶(ALT)活力,在510 nm處測OD值。

1.2.5腎功能指標 收集各組大鼠尿液，用全自動生化分析儀測定尿液中蛋白尿含量。采集大鼠血液，分離血清，用全自動生化分析儀檢測肌酐酸、尿素氮水平。

1.2.6ELISA 取各組大鼠血清，用ELISA試劑盒檢測外周血中炎癥因子IL-6、TNF-α、IL-1β水平，操作按照試劑盒說明書進行。

1.2.7大鼠存活率 統計大鼠建模后96 h內各組大鼠死亡數，每12 h統計一次，計算大鼠存活率。

2 結果

2.1肝腎組織病理損傷 HE染色結果如圖2所示，與CTRL組相比，CLP組大鼠肝組織出現明顯病理損傷、明顯裂痕、細胞不完整、出血、炎癥細胞浸潤等癥狀，說明CLP造成嚴重肝損傷；與CLP組相比，LNZ、TAN組大鼠出血明顯減少，炎癥細胞減少，細胞完整性高，且TAN組大鼠肝組織病理損傷減輕度優于LNZ組；與CTRL組相比，CLP組大鼠腎小球數量減少，腎小管水腫、擴張、空泡化、炎癥細胞浸潤、纖維化、細胞充血，部分區域可見蛋白管型，表現出明顯的腎組織病理損傷；與CLP組相比，LNZ組和TAN組大鼠病理損傷程度有所減輕。

圖2 肝腎組織病理損傷(×400)Fig.2 Pathological damage of liver and kidney tissues(×400)

2.2肝腎組織的細胞凋亡情況 TUNEL染色檢測結果如圖3所示。與CTRL組相比，CLP組大鼠肝腎細胞凋亡率顯著升高(P<0.01)；與CLP組相比較，LNZ、TAN組大鼠肝腎細胞凋亡率顯著降低(P<0.01)。

圖3 TUNEL檢測細胞凋亡Fig.3 TUNEL assays detected cell apoptosisNote:Compared with CTRL group，**.P<0.01；compared with CLP group，##.P<0.01.

2.3肝功能指標 與CTRL組相比，CLP組大鼠ALT、AST水平顯著升高(P<0.01)；與CLP組相比，LNZ、TAN組大鼠ALT、AST水平顯著降低(P<0.01)，見圖4。

圖4 肝功能指標Fig.4 Liver function indexNote:Compared with CTRL group，**.P<0.01；compared with CLP group，##.P<0.01.

2.4腎功能指標 檢測各組腎功能指標血清肌酐、尿素氮、蛋白尿水平，結果如圖5所示，與CTRL組相比，CLP組大鼠血清肌酐、尿素氮、蛋白尿水平顯著升高(P<0.01)；與CLP組相比，LNZ、TAN組大鼠血清肌酐、尿素氮、蛋白尿水平顯著降低(P<0.01)。

圖5 腎功能指標Fig.5 Renal function indexNote:Compared with CTRL group，**.P<0.01；compared with CLP group，##.P<0.01.

2.5炎癥因子水平 與CTRL組相比，CLP組大鼠IL-1β、TNF-α、IL-6水平顯著升高(P<0.01)；與CLP組相比，LNZ、TAN組大鼠IL-1β、TNF-α、IL-6水平顯著降低(P<0.01)，見圖6。

圖6 炎癥因子水平Fig.6 Inflammatory factor levelsNote:Compared with CTRL group，**.P<0.01；compared with CLP group，##.P<0.01.

2.6大鼠存活率 檢測96 h內大鼠存活率，結果如圖7所示，CTRL組大鼠未死亡，與CTRL組相比，CLP組存活率顯著降低(P<0.01)；與CLP組相比較，LNZ、TAN組大鼠存活率顯著升高(P<0.01)。說明丹參酮ⅡA可降低膿毒癥大鼠死亡率。

圖7 大鼠存活率Fig.7 Survival rate of ratsNote:Compared with CTRL group，**.P<0.01；compared with CLP group，##.P<0.01.

3 討論

膿毒癥是一種嚴重的臨床疾病，死亡率很高，是感染誘發的全身嚴重炎癥反應[9]。無論是正常的生理反應還是免疫反應都可以消滅病原體，而膿毒癥的發病機制往往為正常反應的不相容調節[10]。人們普遍認為宿主對膿毒癥的反應與一系列綜合的、伴隨的、拮抗的過程有關，包括免疫抑制和過度炎癥[11]。膿毒癥的發病機制部分是由細菌內毒素介導的，細菌內毒素刺激巨噬細胞和單核細胞先后釋放早期和晚期促炎細胞因子[5]。目前缺乏治療膿毒癥的有效藥物，需要研發新的治療藥物來降低膿毒癥的死亡率[12]。

丹參酮ⅡA是提取自中藥丹參的主要活性成分，為櫻紅色針狀結晶，在心血管領域應用廣泛[13]。丹參酮ⅡA對膿毒癥大鼠心肌具有抗炎、抗氧化、改善凋亡相關基因和鈣調神經素異常表達等作用[14]。目前丹參酮ⅡA對膿毒癥的保護作用和具體機制研究較少，本文采用盲腸結扎穿孔法構建膿毒癥大鼠模型，研究丹參酮ⅡA對膿毒癥大鼠模型肝腎功能的影響。

膿毒癥是急性肝損傷和急性腎損傷最常見的病因之一，而肝腎對機體的重要性不言而喻，因此保證肝腎生理功能的完整性是必要的。有研究表明，丹參酮ⅡA通過抗炎、抗氧化、抗凋亡等作用發揮抗肝損傷作用，促進肝細胞增殖，說明丹參酮ⅡA對肝可能具有保護作用[15]。Chen等[16]研究發現丹參酮 ⅡA通過抑制氧化應激和炎癥減輕STZ誘導的糖尿病大鼠的腎損傷，可將丹參酮 ⅡA作為治療腎損傷的腎保護劑。本研究發現，丹參酮ⅡA具有減輕膿毒癥大鼠肝腎病理損傷程度和調節肝腎功能性指標的作用，提示丹參酮ⅡA具有肝腎保護作用。

凋亡是指細胞的程序性死亡，肝腎細胞凋亡是造成肝腎損傷和肝腎疾病最基本的中心環節,在膿毒癥肝腎損傷的發生發展中具有重要作用。卜克等[17]研究發現H2S通過抑制膿毒癥大鼠腎細胞凋亡改善膿毒癥AKI大鼠腎功能,發揮腎臟保護作用。馮文明等[18]研究發現δ阿片受體激動劑通過抑制肝細胞凋亡對膿毒癥大鼠肝臟起保護作用。本研究發現，丹參酮ⅡA具有抑制膿毒癥大鼠肝腎細胞凋亡的作用,說明丹參酮ⅡA可能通過抑制細胞凋亡對膿毒癥大鼠肝腎起保護作用。

膿毒癥的發病會引發系統炎癥反應綜合征，這說明大量的炎癥因子被釋放到血液中，并到達多個器官進入血液循環，導致多個器官損傷[19]。通過抑制及控制炎癥因子的釋放將有助于膿毒癥病情的改善[20]。炎癥反應引發劑TNF-α常應用于膿毒癥早期診斷，是膿毒癥早期診斷的重要生物標志物。當發生膿毒癥時，大量的TNF-α釋放到血液中并激活巨噬細胞，使其進一步釋放IL-6和IL-1β等炎癥因子，參與炎癥反應和發熱反應[21]。本研究發現，丹參酮ⅡA具有下調膿毒癥炎癥反應的作用。

綜上所述，丹參酮ⅡA具有減輕膿毒癥大鼠急性肝腎損傷的作用：降低肝腎組織病理損傷程度、抑制肝腎細胞凋亡、下調肝功能指標ALT、AST水平、下調腎功能指標血清肌酐、尿素氮、蛋白尿水平，下調炎癥因子IL-6、TNF-α、IL-1β水平、降低膿毒癥大鼠死亡率。本研究尚有不足之處，丹參酮ⅡA劑量單一，具體分子機制尚不明確，故臨床推廣應用丹參酮ⅡA治療膿毒癥還需進一步研究。