長鏈非編碼RNA XIST通過miR-186調控宮頸癌細胞侵襲遷移及凋亡的分子機制①

徐 倩 楊根嶺 張 波 萬 斌 張 瑜

(重慶醫藥高等專科學校藥學院，重慶 401331)

宮頸癌是常見的女性惡性腫瘤，目前主要活療手段為手術治療及放、化療，由于手術治療的局限性及放、化療的毒副作用，基因治療成為研究熱點[1]。宮頸癌的發生與基因調控相關，基因參與腫瘤細胞侵襲遷移等過程，因此，研究宮頸癌發病機制、尋找有效靶基因備受關注[2]。XIST是機體中有廣泛生物學作用的lncRNA，是哺乳動物X染色體失活的調控因子，參與基因組功能發揮、細胞分化等過程[3]。XIST異常表達可能與腫瘤發生相關，高表達XIST的肺癌、前列腺癌等腫瘤細胞惡性程度較高，敲低XIST可抑制腫瘤細胞侵襲并誘導凋亡[4,5]。宮頸癌細胞中XIST表達水平高于癌旁組織，與腫瘤轉移、病理分期等相關[6]。本研究以明確XIST在宮頸癌細胞侵襲遷移和凋亡中的作用為目的，探討其機制，為靶向基因治療宮頸癌提供新思路。

1 材料與方法

1.1材料 人宮頸癌CaSki細胞購自通派(上海)生物科技有限公司；Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司；XIST shRNA和shRNA control購自長沙贏潤生物技術有限公司；miR-186 inhibitor、inhibitor control購自廣州市銳博生物科技有限公司；miR-186 mimics、mimics control購自上海吉瑪制藥技術有限公司；引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；Cleaved Caspase-3抗體、MMP-2抗體購自美國Cell Signaling Technology公司；MMP-9抗體購自美國Bio Vision公司。

1.2方法

1.2.1細胞轉染 CaSki細胞接種于6孔板，細胞融合度為60%時用轉染試劑Lipofectamine 2000將XIST shRNA和shRNA control轉染至細胞中。將轉染XIST shRNA和shRNA control后的細胞記為sh-XIST和sh-NC，未轉染細胞為Control。

1.2.2qRT-PCR檢測XIST shRNA對宮頸癌細胞中XIST表達的影響 Control、sh-NC、sh-XIST組細胞轉染后繼續培養48 h，分別提取總RNA，All-in-oneTMFrist-Strand cDNA Synthesis Kit合成cDNA，步驟同試劑盒說明書。引物序列為：XIST F：5′-CAGACGTGTGCTCTTC-3′R：5′-CGATCTGTAAGTCCA-CCA-3′, GAPDH F：5′-AACGTGTCAGTGGTGGACC-TG-3′，R：5′-AGTGGGTGTCGCTGTTGAAGT-3′。合成的cDNA用SYBR Green熒光定量PCR試劑盒擴增，2-ΔΔCt法計算XIST表達變化。

1.2.3流式細胞術檢測XIST shRNA對宮頸癌細胞凋亡的影響 各組細胞轉染后繼續培養48 h，胰蛋白酶消化，PBS洗滌2次，以1×Binding Buffer細胞，調整細胞濃度為1×107個/ml。收集1 ml細胞，1 000 r/min離心10 min，棄上清，加入Binding Buffer 500 μl，Annexin V-FITC和PI染液孵育15 min。流式細胞儀檢測細胞凋亡變化。

1.2.4Transwell小室實驗檢測XIST shRNA對宮頸癌細胞侵襲和遷移的影響 Transwell小室上室添加不含血清的細胞培養液懸浮的細胞200 μl，下室添加含有10%胎牛血清的細胞培養液500 μl，置于培養箱中孵育48 h，將培養板取出，PBS洗滌，添加4%多聚甲醛溶液在室溫中孵育30 min，結晶紫染色，顯微鏡下觀察細胞穿膜數量即為細胞遷移數目。侵襲實驗前2 h添加Matrigel濕化小室，其余步驟同遷移實驗。

1.2.5Western blot檢測XIST shRNA對宮頸癌細胞Cleaved Caspase-3、MMP-2和MMP-9蛋白表達的影響 各組細胞轉染后繼續培養48 h，添加RIPA裂解液及蛋白酶、磷酸酶抑制劑，置于冰上裂解30 min，低溫高速離心10 min。取上清，BCA法定量檢測蛋白。分別配制分離膠(10%)和濃縮膠(5%)，每孔添加30 μg蛋白樣品，90 V恒壓電泳，肉眼可見溴酚藍進入到凝膠底部后停止電泳，4℃、70 V電壓下轉移至NC膜，轉膜時間為60 min。NC膜于5%脫脂奶粉中室溫封閉2 h，置于一抗反應液(Cleaved Caspase-3、MMP-2和MMP-9以1∶400稀釋)中4℃過夜，加入1∶2 000稀釋的二抗，加入室溫孵育2 h，ECL法化學發光。記錄目的條帶Cleaved Caspase-3、MMP-2、MMP-9及內參條帶GAPDH灰度值，分析目的蛋白表達水平。

1.2.6靶基因預測和鑒定 Starbase軟件預測XIST與miR-186互補結合位點，將XIST互補結合位點突變，構建突變型熒光素酶報告載體(XIST-MUT)及野生型熒光素酶報告載體(XIST-WT)，Lipofectamine 2000分別將XIST-MUT、XIST-WT和miR-186 mimics、mimics control共轉染至CaSki細胞，培養48 h，熒光素酶活性測定試劑盒檢測熒光素酶活性。

1.2.7qRT-PCR檢測XIST shRNA對宮頸癌細胞miR-186表達的影響 各組細胞轉染后繼續培養48 h，按照1.2.2各組測定細胞miR-186表達變化，評估XIST對miR-186的調控作用，內參為U6，引物為：U6 F：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，R：5′-AACG-CTTCACGAATTTGCGT-3′，miR-186 F：5′-CGACGCGT-CGGTTTACAGAACAGGGATCA-3′，R：5′-CCATCGATGGGGCACAGCAACAAAAGACT-3′。

1.2.8miR-186 inhibitor對XIST shRNA影響宮頸癌細胞侵襲遷移和凋亡的影響 Lipofectamine 2000分別將inhibitor control、XIST shRNA和miR-186 inhibitor、XIST shRNA共轉染至CaSki細胞，記為sh-XIST+Anti-NC和sh-XIST+Anti-miR-186，培養 48 h，qRT-PCR檢測細胞miR-186表達變化，流式細胞術檢測細胞凋亡，Transwell小室檢測細胞侵襲和遷移，Western blot檢測細胞Cleaved Caspase-3、MMP-2和MMP-9蛋白表達水平。

2 結果

2.1XIST shRNA抑制宮頸癌細胞XIST表達 宮頸癌細胞中轉染XIST shRNA后，XIST表達水平明顯降低(P<0.01)，說明XIST shRNA可抑制宮頸癌細胞XIST表達，見表1。

表1 XIST shRNA轉染后宮頸癌細胞中 XIST表達變化

2.2下調XIST對宮頸癌細胞侵襲遷移和凋亡的影響 轉染XIST shRNA后宮頸癌細胞凋亡率升高，細胞侵襲和遷移數目降低，說明下調XIST可抑制宮頸癌細胞侵襲和遷移，誘導細胞凋亡，見圖1、表2。

圖1 流式細胞術檢測XIST shRNA轉染后宮頸癌細胞凋亡Fig.1 Detection of apoptosis in cervical camcer cells after transfection with XIST shRNA by folw cytometry

表2 XIST shRNA轉染后宮頸癌細胞凋亡率、細胞侵襲和遷移數目

2.3下調XIST對宮頸癌細胞Cleaved Caspase-3、MMP-2和MMP-9蛋白表達的影響 轉染XIST shRNA后，宮頸癌細胞MMP-2和MMP-9蛋白表達水平降低，Cleaved Caspase-3蛋白表達水平升高，說明下調XIST可抑制宮頸癌細胞MMP-2和MMP-9蛋白表達并促進Cleaved Caspase-3表達，見圖2、表3。

圖2 Western blot檢測XIST shRNA轉染后宮頸癌細胞Cleaved Caspase-3、MMP-2和MMP-9蛋白表達水平Fig.2 Expressions of Cleaved Caspase-3,MMP-2 and MMP-9 in cervical cancer cells after XIST shRNA transfection by Western blot

表3 XIST shRNA轉染后宮頸癌細胞中Cleaved Caspase-3、MMP-2和MMP-9蛋白水平

2.4XIST靶向調控miR-186 Starbase軟件預測到miR-186與XIST存在互補結合位點，XIST-WT與miR-186 mimics共轉染下調宮頸癌細胞熒光素酶活性，XIST靶向調控miR-186，見圖3、表4。

圖3 Starbase軟件預測miR-186與XIST互補結合位點Fig.3 Prediction of complementary binding sites between miR-186 and XIST by Starbase software

表4 熒光素酶報告載體鑒定靶向關系

2.5XIST shRNA提高宮頸癌細胞miR-186表達 轉染XIST shRNA后宮頸癌細胞miR-186表達水平升高，說明下調XIST可促進宮頸癌細胞miR-186表達，見表5。

表5 XIST shRNA對宮頸癌細胞miR-186表達的影響

2.6下調miR-186對XIST shRNA抑制宮頸癌細胞侵襲遷移和誘導凋亡的影響 miR-186 inhibitor和XIST shRNA共轉染可下調宮頸癌細胞miR-186表達，減少細胞凋亡并促進宮頸癌細胞侵襲和遷移(P<0.05)，說明miR-186 inhibitor可逆轉XIST shRNA對宮頸癌細胞侵襲遷移和凋亡的影響，見圖4、表6。

圖4 miR-186 inhibitor和XIST shRNA共轉染對宮頸癌細胞凋亡和Cleaved Caspase-3、MMP-2、MMP-9蛋白表達影響Fig.4 Effect of co-transfection of miR-186 inhibitor and XIST shRNA on apoptosis and Cleaved Caspase-3,MMP-2,MMP-9 expressions of cervical cancer cellsNote:1.sh-XISF+Anti-NC;2.sh-XIST+Anti-miR-186.

表6 miR-186 inhibitor和XIST shRNA共轉染后宮頸癌細胞凋亡、侵襲遷移和Cleaved Caspase-3、MMP-2、MMP-9蛋白表達變化

3 討論

本研究發現XIST表達降低后宮頸癌細胞凋亡率提高，細胞侵襲和遷移能力下降，說明下調XIST可抑制宮頸癌細胞生長，XIST可能是宮頸癌治療的潛在靶點。本研究進一步明確了XIST的作用機制，發現miR-186可靶向結合XIST，XIST表達下調可提高細胞miR-186表達，抑制miR-186表達可逆轉XIST下調對宮頸癌細胞的抵抗作用，證明下調XIST可靶向提高miR-186誘導宮頸癌細胞凋亡和抑制細胞侵襲遷移。

lncRNA是新近發現的非編碼RNA，其表達具有組織、空間或時間特異性，參與干細胞激活、細胞凋亡、細胞分化等生物學過程，與腫瘤的關系備受關注[7-9]。XIST只能從失活的X染色體中轉錄，與人類基因組維護、細胞凋亡等有關，可通過影響染色質的穩定調控基因表達[10-12]。XIST參與腫瘤進展，在腫瘤組織中異常表達與腫瘤惡性程度相關，在肺癌、胃癌、上皮性卵巢癌等腫瘤中已經發現其可發揮類似癌基因的作用促進腫瘤進展[13-15]。XIST可促進胰腺癌細胞生長，在前列腺癌中發揮癌基因作用，下調XIST可抑制肺癌細胞侵襲和遷移，表明XIST可促進腫瘤惡性進展，與前人研究結果一致，因此，靶向抑制XIST可能是宮頸癌治療途徑之一[5,16,17]。

Cleaved Caspase-3是細胞凋亡的標志因子，Caspase-3是Caspase凋亡反應中的下游執行子，活化后形成Cleaved Caspase-3促進細胞凋亡[18]。MMP-2和MMP-9均屬于基質金屬蛋白酶家族，可降解細胞外基質，促進腫瘤轉移[19]。miR-186在腫瘤中低表達，可抑制宮頸癌細胞侵襲和遷移，抑制宮頸癌惡性進展[20]。本研究證實XIST下調可抑制宮頸癌細胞MMP-9和MMP-2蛋白表達，并促進Cleaved Caspase-3蛋白表達，此作用機制與靶向負調控miR-186表達相關，下調XIST可通過促進宮頸癌細胞miR-186表達減少細胞合成MMP-9、MMP-2，并促進Cleaved Caspase-3表達，這可能是下調XIST抑制宮頸癌細胞侵襲遷移和誘導凋亡的機制，miR-186如何調控MMP-9、MMP-2、Cleaved Caspase-3蛋白表達的具體機制尚不明確，需要進一步探討。

綜上，XIST可能是宮頸癌治療的潛在靶點，下調XIST靶向miR-186作用可抑制宮頸癌細胞侵襲遷移并誘導凋亡，為研究XIST在腫瘤中的調控網絡提供參考。