不同浮游植物葉綠素a提取方法的比較研究

江天棋，張 揚，姜亞洲，孫 鵬，凌建忠，唐保軍

（1.上海海洋大學水產科學國家級實驗教學示范中心，上海201306；2.中國水產科學研究院東海水產研究所，上海 200090；3.上海海洋大學海洋生物科學國際聯合研究中心，上海 201306）

葉綠素a（Chla）是估算海洋初級生產力和評估海水富營養化程度的重要指標之一［1］。準確測定水體中Chla濃度對于評價水體營養狀態及水域生態系統修復狀況具有重要意義［2］。雖然水體Chla濃度的測定方法已有國家標準（GB 17378.7 2007、GB／T 12763.6 2007）和環境保護標準（HJ 897 2017）［3－5］可參考，但在實際分析操作中仍存在一些尚未解決的問題。比如，上述標準都采用了玻璃纖維濾膜，但出于成本考慮，纖維素酯類膜仍被許多研究單位使用，而纖維素酯類膜在丙酮中溶解不完全，存在微細膠體顆粒，這些顆粒在多大程度上會影響比色結果尚不明確。在提取方法上，GB 17378.7 2007標準是加90%丙酮溶液后振蕩，HJ 897 2017標準則采用了研磨方法；在提取時間、樣品保存時間方面兩個標準也有所不同。此外，單胞藻經常作為指示物應用在濾食性動物濾水率的測定中［6－7］，而有研究表明丙酮對柵藻（Scenedesmussp.）、小球藻（Chlorellasp.）、微擬球藻（Nannochlorissp.）等綠藻的提取效果不佳［8－9］，雖然研磨、勻漿、超聲等方法可以提高有機溶劑對Chla的提取效果［10］，但對不同單胞藻類Chla提取率的影響程度如何，尚待進一步研究。

本文選擇了2種綠藻和1種硅藻，分析了不同濾膜和提取溶劑對Chla濃度測定結果的影響，比較了不同樣品提取時間、保存時間以及研磨和凍融兩種方法下丙酮對Chla的提取效果，并探討了如何降低纖維素酯類膜溶解后的微小顆粒對測定結果的影響，以期為海水Chla濃度的分析測定提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗 采 用3種 濾 膜：孔 徑0.7μm的Whatman GF／F玻璃纖維濾膜（GE healthcare life sciences）、孔徑0.45μm的混合纖維素酯（水系）濾膜和孔徑0.45μm的聚偏氟乙烯微孔濾膜（上海興亞凈化材料廠）；3種單胞藻類（包含2種綠藻和1種硅藻）：蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidesa）、亞心形扁藻（Platymonas subcordiformis）和牟氏角毛藻（Chaetoceros muelleri）；3種提取溶劑：90%丙酮、90%乙醇和甲醇。其他試劑和設備包括：碳酸鎂懸濁液、真空泵（津騰GM 0.5A）、臺式離心機（湘儀TG 16WS）、紫外可見分光光度計（上海精科752N）。

1.2 實驗方法

1.2.1 水樣采集和處理

為模擬海水環境，以海水晶（浙江藍海星）配制鹽度為25的海水，然后分別加入各單胞藻液。水樣的過濾、Chla提取流程均參照GB 17378.7 2007《海洋監測規范第7部分：近海污染生態調查和生物監測》［3］中Chla濃度的測定（分光光度法）。樣品采集后立即測定。對于比較凍融法與研磨法以及不同保存時間的樣品，則在水樣剛剛抽干后，將濾膜（添加碳酸鎂）對折，用錫箔紙封好，放到棕色塑料瓶中，置于－20℃保存。

1.2.2 不同濾膜和提取溶劑對Chla濃度測定結果的影響

配制海水50 L，加入100 mL蛋白核小球藻，充分混勻，分別用上述3種濾膜抽濾1 L水樣。采用凍融法［11］，將濾膜在－20℃冷凍1 h，取出室溫融解20 min，反復5次。然后將濾膜放入具塞離心管，分別加10 mL 90%丙酮、90%乙醇和甲醇，每種提取溶劑設4個平行，置于4℃避光浸泡12 h，3 500 r·min－1離心10 min提取Chla。牟氏角毛藻測定操作同上。

用分光光度法測定各Chla提取液在600～750 nm的吸收光譜。

1）對90%丙酮提取液，測定波長750、664、647、630 nm處的吸光度值，參照GB 17378.7 2007標準，Chla濃度計算公式如下：

式（1）中，E750、E664、E647、E630分別為波長750、664、647、630 nm處提取液的吸光度值，V丙酮為丙酮提取液體積（mL），V水樣為過濾水樣的體積（L），δ為比色皿光程（cm）。

2）參照金霞等［12］，體積分數為90%的丙酮比吸光系數為89，而體積分數90%乙醇的比吸光系數為87，因此用式（1）乘以1.023，得到如下公式：

式（2）中符號意義同式（1）。

3）對甲醇提取液，參照PORRA［8］方法，測定波長750、665、652 nm處的吸光度值，Chla濃度計算公式如下：式（3）中，E750、E665、E652分別為波長750、665、652 nm處提取液的吸光度值，其余符號意義同式（1）。

1.2.3 不同提取方法對Chla濃度測定結果的影響

根據上述實驗結果，采用玻璃纖維濾膜和90%丙酮，分析凍融和研磨對3種藻Chla濃度測定結果的影響。每種藻設4個平行。凍融操作同1.2.2。研磨操作參照HJ 897 2017標準［5］，采用10 mL玻璃勻漿器，加入6 mL 90%丙酮溶液，充分研磨5 min以上，沖洗，轉移至玻璃刻度離心管中，定容至10 mL，置于4℃避光浸泡12 h，3 500 r·min－1離心，分光光度法測定Chla濃度。

1.2.4 不同提取時間對Chla濃度測定結果的影響

以玻璃纖維濾膜和90%丙酮為提取溶劑，采用凍融法提取Chla，方法同1.2.2，分別在加入提取劑后6、12、24、48、72、96 h通過分光光度法測定Chla濃度。每個時間點設4個平行。

1.2.5 不同樣品保存時間對Chla濃度測定結果的影響

以玻璃纖維濾膜和90%丙酮為提取溶劑，水樣過濾后分別保存0、7、15、30、60 d。采用凍融法提取Chla，分光光度法測定Chla濃度。每個時間點設4個平行。

1.3 數據分析

實驗所得數據以平均數±標準差的形式表示，采用SPSS16.0軟件先對數據進行正態化檢驗，符合正態分布的進行單因子方差分析和雙因子方差分析，并對不同濾膜與提取介質、不同提取時間和保存時間的測定結果進行多重比較，以P＜0.05和P＜0.01表示差異有顯著和極顯著意義。

2 結果與分析

2.1 不同濾膜和提取溶劑對Chla濃度測定結果的影響

實驗發現，玻璃纖維濾膜抽濾水樣速度最快，1 L水樣約需2～5 min；聚偏氟乙烯微孔濾膜抽濾速度最慢，1 L水樣約需45～60 min。加入90%丙酮后，混合纖維素濾膜完全溶解，聚偏氟乙烯濾膜和玻璃纖維濾膜仍保持完整。加入90%乙醇后，3種濾膜都沒有明顯變化。加入甲醇后，混合纖維素濾膜部分溶解，呈懸濁狀態，聚偏氟乙烯濾膜和玻璃纖維濾膜仍保持完整。

圖1 不同濾膜和提取溶劑對蛋白核小球藻Chla濃度測定的影響Fig.1 Effects of filter membranes and extraction solvents on measured Chla concentrations of C.pyrenoidesa

雙因子方差分析表明，不同濾膜和提取溶劑均對蛋白核小球藻Chla測定結果有極顯著差異（P＜0.01），90%丙酮提取的Chla測定結果極顯著低于其他兩種介質（P＜0.01）（圖1）。混合纖維素濾膜和聚偏氟乙烯濾膜測定結果無顯著差異（P＝0.54）。不同濾膜和提取溶劑均對牟氏角毛藻Chla濃度測定結果有極顯著影響（P＜0.01）（圖2）。

為了判斷甲醇溶解濾膜對測定結果的影響，采用3 500 r·min－1（850 g）和8 000 r·min－1（4 450 g）兩種轉速對提取液進行離心。結果顯示，3 500 r·min－1離心后，混合纖維素濾膜提取液仍呈懸濁狀態，而8 000 r·min－1離心后，提取液上部澄清。結果表明，轉速升高后，混合纖維素濾膜測定的Chla濃度顯著下降（P＜0.01）（圖3），玻璃纖維濾膜測定結果雖然也顯著下降（P＜0.05），但幅度較小，而聚偏氟乙烯濾膜無顯著差異。

圖2 不同濾膜和提取溶劑對牟氏角毛藻Chla濃度測定的影響Fig.2 Effects of filter membranes and extraction solvents on measured Chla concentrations of C.muelleri

圖3 不同離心轉速下甲醇提取蛋白核小球藻Chla濃度測定結果Fig.3 Determ ination of Chla concentrations in C.pyrenoidosa by methanol extraction at different centrifugal speeds

2.2 不同提取方法對Chla濃度測定結果的影響

結果顯示，采用凍融法測定的牟氏角毛藻和亞心形扁藻Chla濃度值均高于研磨法（圖4），但雙因子方差分析表明兩種處理方法之間無顯著性差異。凍融法測定的蛋白核小球藻Chla濃度極顯著低于研磨法（P＜0.01），僅為研磨法的1／24。

圖4 不同提取方法對不同藻類Chla濃度測定結果的影響Fig.4 Effects of extraction methods on measured Chla concentrations of threem icroalgae

2.3 不同提取時間對Chla濃度測定結果的影響

結果顯示，不同提取時間對牟氏角毛藻Chla的測定結果有顯著影響（圖5）。提取12 h的Chla濃度顯著高于其他時間點（P＜0.05），提取6 h的Chla濃度則顯著低于其他時間點（P＜0.05），24～96 h的Chla濃度無顯著差異。

圖5 不同提取時間對牟氏角毛藻Chla濃度測定結果的影響Fig.5 Effects of extraction time on measured Chla concentrations of C.muelleri

2.4 樣品保存時間對Chla濃度測定結果的影響

結果顯示，隨著樣品保存時間的延長，Chla濃度的測定結果逐漸降低（圖6），冷凍保存7 d后即出現顯著降低（P＜0.05）；但在7～30 d之間，Chla濃度的測定結果無顯著差異；樣品保存60 d后Chla濃度的測定結果極顯著降低（P＜0.01）。

圖6 不同樣品保存時間對牟氏角毛藻Chla濃度測定結果的影響Fig.6 Effects of sam p le preservation tim e on measured Chla concentrations of C.muelleri

3 討論

本實驗中，玻璃纖維濾膜在加入3種抽提劑后保持完整，測定的Chla濃度結果也相對穩定。混合纖維素濾膜加入抽提介質后易造成液體渾濁，影響比色結果，有機系的聚偏氟乙烯濾膜則過濾速度較慢，不適合大量樣品分析。寧修仁［13］報道，使用Whatman GF／C玻璃纖維濾膜加碳酸鎂，測定海水浮游植物Chla濃度效果最佳。這是因為碳酸鎂具有防止葉綠素分解的作用，而玻璃纖維濾膜在丙酮中的不可溶性，提高了比色測定的準確性。林少君等［11］使用醋酸纖維濾膜、微孔濾膜和GF／F玻璃纖維濾膜抽濾微囊藻水樣，發現各濾膜對Chla濃度測定結果影響不顯著。但吳妹英［14］報道，使用玻璃纖維濾膜測得的Chla濃度顯著高于使用醋酸纖維素濾膜和微孔濾膜測得的結果。結合本文實驗研究結果，可以認為玻璃纖維濾膜比較適宜海水Chla濃度分析。

本實驗中，使用丙酮凍融法提取的蛋白核小球藻Chla濃度測定結果大幅低于乙醇和甲醇，表明丙酮對蛋白核小球藻Chla的提取效果不好。已有研究表明，丙酮對柵藻、小球藻、微擬球藻等綠藻的提取效果不佳［8－9，15］。研究表明，綠藻和藍藻中Chla較難提取，通常需要機械破碎細胞［16－17］。本研究中，蛋白核小球藻經研磨后測定結果大幅提高，應與此有關。但對同屬綠藻門的亞心形扁藻，丙酮凍融和研磨提取的Chla濃度無顯著性差異，表明丙酮對Chla的提取效果有種間差異。我國沿海海水中浮游植物主要為硅藻和甲藻［18－20］，采用丙酮作為提取溶劑對測定結果影響不大。但如果因環境條件改變導致海水中小球藻等綠藻的含量升高，凍融法會造成測定結果偏低。在養殖池塘水體中，綠藻占比較高［21－23］，在對其進行養殖環境的監測時，應注意丙酮提取方法可能導致的結果差異。

小球藻Chla濃度測定結果表明，乙醇提取效果優于甲醇和丙酮。不同提取劑的提取效果也與藻類種類有關［24－25］。陳紀新等［26］報道，丙酮、甲醇和乙醇對鹽生杜氏藻（Dunaliellasalina）、角毛藻（Chaetocerossp.）、赫胥黎艾氏藻（Emilliania huxleyi）的Chla提取效果無顯著性差異。WASMUND等［27］發現乙醇對于以甲藻和硅藻為主的海水Chla的提取效果優于丙酮。但ROIJACKERS［28］報 道 丙 酮 對 阿 氏 顫 藻（Oscillatoriaagardhii）、美麗團藻（Volvoxaureus）和Pennales目硅藻的提取效果比乙醇好，3種藻之間無差異。甲醇對銅綠微囊藻（Microcystisaeruginosa）Chla的提取效果優于丙酮和乙醇［29］。但甲醇可部分融解混合纖維素濾膜，形成凝膠狀顆粒懸濁，干擾測定結果。本實驗結果還表明，對于玻璃纖維濾膜和聚偏氟乙烯濾膜，離心轉速對測定結果影響不大。

一般來說，研磨破碎細胞可提高Chla的提取率［27，30］。本實驗中，凍融法測定的亞心形扁藻和牟氏角毛藻Chla濃度卻高于研磨法。此前也有研究表明，凍融法測定Chla濃度的結果高于研磨法［11，31］。這可能是因為反復凍融法是利用細胞內冰粒形成和細胞液濃度的增高引起溶脹來達到破損細胞壁的目的，而研磨操作步驟多，樣品轉移過程中可能造成損失，這應該是造成研磨法測定結果偏低的原因［32］。林少君等［11］認為，凍與融的時間比例大概為20 min∶5 min，融解時間最好不要超過10 min。本實驗中凍、融時間分別為1 h、20 min，也取得了比較好的效果，說明凍融時間的長短對結果影響不大。

不同提取時間的結果顯示，提取12 h的Chla濃度測定值最高，這與GB 17378.7 2007和HJ 897 2017標準一致。吳妹英［14］也發現，4℃下提取16 h，Chla濃度值趨于穩定，而24 h后，Chla濃度值緩慢下降。有研究報道［33－34］，升高溫度可縮短Chla的提取時間?？紤]到操作簡便性，建議Chla的提取時間為12 h以上、不超過24 h。

在實際的海洋調查監測工作中，經常遇到因條件所限無法現場測定，導致水樣抽濾后保存時間較長的問題。王秋麗［35］報道，冷凍保存7～14 d后，Chla損失約15%，冷凍保存30 d后，Chla損失約20%。本實驗中，樣品冷凍保存15 d后Chla損失7%，保存30 d后損失12%，而保存60 d后損失高達22%。因此，水樣抽濾后，最好在15 d內完成測量，以確保監測結果的準確性。

綜上，在測定不同藻類的葉綠素a含量時，采用玻璃纖維濾膜過濾水樣、凍融法提取12～24 h后測定效果最好，水樣抽濾后保存時間不宜超過15 d，對蛋白核小球藻應采用研磨法提取Chla。

致謝：本實驗得到溫州大學馬增嶺老師和上海海洋大學沈盎綠老師的指導，在此一并表示感謝。