脫氮除磷益生菌對養殖尾水處理的研究進展

劉慶輝，余祥勇，張鶴千，李 禎，葉孝飛，唐匯娟

（華南農業大學海洋學院，廣州 510642）

根據《2017中國漁業統計年鑒》［1］，2016年我國水產養殖產量達到5 142.39萬t，同比增長4.14%，占世界水產養殖產量的60%以上。漁業產業快速發展的同時，我國的水產養殖向著高密度和高投入的集約化、規模化養殖模式轉變，大量投餌和濫用抗生素等使養殖水環境污染加劇，水生生物病害頻發。《第一次全國污染源普查公報》［2］顯示，水產養殖污染物排放量占農業總排放量的4%，其中化學需氧量（COD）為55.83萬t，總氮（TN）為8.21萬t，總磷（TP）為1.56萬t。

益生菌是指由分離自宿主體內的健康菌群制成的活菌制劑及微生物發酵產品。早在1965年，LILLY等［3］將益生菌定義為“一種可以分泌促進其他生物生長物質的微生物”，即“probiotic”。VERSCHUERE等［4］在2000年將水產益生菌的概念擴展為“一種通過調節宿主相關菌群或周圍環境而對宿主產生有益作用的活的微生物”，并認為益生菌作為飼料添加劑能夠增強飼料的營養價值和利用率，提高宿主免疫力并改善水體環境。近些年，關于益生菌凈化水質、高效降解有機污染物等方面的研究成為熱點，BYOD等［5］指出益生菌可以促進水體中有機物質的分解，降低氮、磷濃度，增加溶解氧，控制氨氮、亞硝酸鹽、硫化氫的含量，為水產生物提供健康的生存環境。本文將從氮磷毒性機理、益生菌脫氮除磷原理、益生菌對養殖尾水作用3個方面以及益生菌的應用和展望進行綜述，以期為益生菌應用于養殖尾水處理提供參考。

1 氮、磷對水生生物的毒害機理

養殖水體中的主要污染物是動物尸體、糞便、殘餌等有機顆粒污染物以及氮、磷等無機污染物，細菌對糞便、殘餌等進行分解之后會產生大量氨氮、亞硝酸鹽、硝酸鹽以及活性磷酸鹽。FUNGE等［6］在精養蝦池的物質平衡研究中發現，僅有10%的氮和7%的磷被蝦利用，其余皆以各種形式進入水環境中。研究發現，養殖過程中有約85%的污染物來自養殖本身，其中殘餌占35%，排泄物占50%［7］。WALLIN和HAKASON［8］認為餌料中的磷只有5%～30%被魚吸收，16%～26%溶于水中，51%～59%以顆粒態存在。此外，濫用化學藥品和抗生素也會導致養殖水體氮磷負荷增加［9］。

氮磷含量超標會引起水生生物出現應激狀態并引發一系列生理響應。氨氮過高會引起魚類代謝狀態發生變化，非離子氨會與肌膜中的K＋進行競爭，影響肌肉的正常收縮；非離子氨具有神經毒性，通過誘導神經元去極化和ATP腺甘三磷酸耗竭，導致細胞死亡［10］。亞硝酸鹽是氮循環中的天然成分，通常以低濃度存在于水環境中，然而在高密度的養殖模式下，養殖水體中亞硝酸鹽含量嚴重超標。高濃度亞硝酸鹽會刺激骨骼肌細胞和紅細胞中K＋的流出，擾亂細胞內外的K＋水平；血紅細胞中的二價鐵會被亞硝酸鹽氧化成三價鐵，導致形成高鐵血紅蛋白，從而降低血液的攜氧能力；最后，亞硝酸鹽能夠產生并能模仿NO，干擾激素的調節過程［11］。KIM等［10］以牙鲆（Paralichtliysolivaceus）為實驗對象，證明了不同形態無機氮對牙鲆的毒性大小為：氨氮＞亞硝酸鹽＞硝酸鹽。磷酸鹽是水生微藻進行光合作用合成有機物的原料之一，磷酸鹽過量會導致藍藻等有害微藻加速生長，形成藻華，微藻在大量繁殖死亡后被微生物分解產生羥胺、硫化氫等有毒物質，間接威脅水生生物的生長。

2 益生菌脫氮除磷作用原理

2.1 氮元素的去除途徑

微生物對氮元素降解和轉化途徑主要分為兩種：硝化與反硝化作用，同化性硝酸還原作用。硝化作用是指由硝化細菌作用產生硝酸鹽的過程，該過程在好氧情況下發生，主要分為兩個階段［12］：首先，在亞硝酸細菌（即氨氧化細菌）的作用下，將氨氮經羥胺轉化為亞硝酸鹽，由氨單加氧酶（ammoniamonooxygenase，AMO）和羥胺氧化還原酶（hydroxylamine oxidase，HAO）催化；其次，硝酸細菌（即亞硝酸鹽氧化細菌）利用亞硝酸鹽氧化酶（nitrite oxidase，NIO）將亞硝酸鹽轉化為毒性較低的硝酸鹽，總反應式為：NH4＋＋2O2＝NO3－＋2H＋＋H2O。在自然環境中，除自養細菌硝化作用外，部分細菌、真菌和放線菌可以進行異養硝化作用，將銨鹽轉化為亞硝酸鹽和硝酸鹽，但其對銨鹽的氧化效率遠遠低于自養硝化細菌。HOOPER等［13］研究發現，異養硝化菌進行代謝時，具有與硝化細菌相似的反應酶系統，即由AMO氧化銨鹽生成羥胺，再由HAO氧化得到亞硝酸鹽。反硝化作用是指反硝化細菌作用于亞硝酸鹽和硝酸鹽生成N2或者N2O的過程，該過程在厭氧情況下發生。反硝化細菌多為異養菌且種類較少，其以有機物作為碳源進行無氧呼吸，其反應式可表示為：6 NO3－＋5CH3OH＝5CO2＋3N2＋7H2O＋6OH－，此過程在還原亞硝酸鹽和硝酸鹽的同時，還可以使有機物氧化分解，降低水中生化需氧量（BOD）。

同化性硝酸還原作用指異養細菌將亞硝酸鹽和硝酸鹽還原成氨氮，氨氮再經一系列反應被同化為細菌蛋白的過程，即：硝酸鹽→亞硝酸鹽→氨氮→有機態氮［14］。自然環境中氨氮可以直接被細菌同化吸收，而硝酸鹽和亞硝酸鹽需要還原成氨氮才可被利用，所以細菌以硝酸鹽作氮源合成有機物需要消耗更多的能量［15］。

2.2 磷元素的去除途徑

國內外公認的微生物除磷機理包括好氧聚磷細菌和兼性厭氧反硝化聚磷細菌除磷機理。聚磷菌（PAOs）在好氧條件下大量吸收磷酸鹽合成自身核酸和ATP，并將過量磷酸鹽合成多聚物存于體內，供其內源呼吸作用。主要包括兩個階段：厭氧時放磷并合成大量β 羥基丁酸聚合物（PHAs）；好氧時PHAs減少，聚磷增加［16］。厭氧條件下，聚磷菌分解體內的多聚磷酸鹽（Poly P）產生ATP，促進乙酸活化產生乙酰輔酶A，并進一步生成PHAs，同時將ATP中的磷酸鹽釋出。好氧條件下，合成的PHAs被菌體分解，其內部貯藏的能量被釋放產生質子推動力（pmf），pmf將胞外磷酸鹽運輸到胞內合成ATP和核酸，并將過剩磷酸鹽合成Poly P，以維持pmf穩定。好氧時Poly P的合成取決于厭氧時PHAs的合成情況，二者呈正相關，所以聚磷菌高效除磷主要是因為厭氧條件下合成大量的PHAs在好氧條件下分解，導致菌體過量吸收胞外磷酸鹽以供自提代謝所需［17］。聚磷菌磷代謝過程如圖1所示［18］：

圖1 聚磷細菌磷代謝過程Fig.1 Phosphorusmetabolism of phosphorus accumulating bacteria

反硝化除磷現象由OSBORN等［19］于1977年首次發現，并逐步成為生物除磷領域研究的熱點。COMEAU［20］和VLEKKED［21］發現一些聚磷細菌能夠利用硝酸鹽作為電子受體吸收磷；KUBA［22］研究指出，在厭氧／好氧交替狀態下，容易培養出一類以硝酸鹽作為電子受體進行反硝化吸磷作用的優勢菌種；隨后有學者證明亞硝酸鹽也可以作為電子受體進行反硝化除磷［23］。關于反硝化除磷現象，學者們提出3種假說進行闡釋［24］：1）一類菌屬學說，指在生物除磷系統中僅存在一種具有反硝化能力的聚磷菌，其反硝化作用的強弱取決于厭氧／缺氧狀態的交替情況；2）兩類菌屬學說，指生物除磷系統中存在兩類聚磷菌，其中一類僅可以氧氣作為電子受體進行吸磷，另一類既能以氧氣作為電子受體，又能以硝酸鹽作為電子受體，在吸磷的同時能進行反硝化作用；3）三類菌屬學說，指在生物除磷系統中，還存在以亞硝酸鹽為電子受體的聚磷菌。當厭氧／缺氧狀態得到強化時，一些聚磷菌反硝化作用增強，其利用硝酸鹽為電子受體，分解PHAs釋放能量并大量攝取胞外磷合成ATP和Poly P，硝酸鹽則被還原成N2釋放。由此可見，聚磷菌的反硝化作用可以使水體中氮、磷元素皆被去除，而PHAs則是反硝化除磷的關鍵物質。

3 益生菌脫氮除磷研究進展

近年來，利用有益菌對養殖水環境進行修復逐漸成為研究的重點。養殖水體主要以無機氮磷污染為主，其次為殘餌、生物代謝物等有機顆粒污染，污染成分相對簡單，而這些“污染成分”對細菌來說，是絕佳的營養來源。細菌能夠快速分解水中有機物，并能通過自身代謝實現對水體中氮磷元素的高效吸收。目前，關于益生菌處理養殖尾水的研究主要分為單菌株作用、復合菌株作用、益生菌與水生植物共同作用3個方面。

3.1 單種益生菌的作用效果研究

針對益生菌脫氮除磷的特性，很多學者將其應用到養殖尾水的治理，且效果顯著優于物理化學等傳統治理方法。單一菌株在養殖水體治理中應用比較廣泛的主要有芽孢桿菌（Bacillus）、光合細菌（photosynthetic bacteria，PSB）以及硝化細菌（nitrifying bacteria）。

芽孢桿菌是好氧或兼性厭氧的革蘭氏陽性菌，在生長過程中分泌大量胞外酶，如蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶等，通過這些酶快速分解有機物以供自身代謝所需［25］。楊世平等［26］研究表明，產乳酸芽孢桿菌對對蝦水質有明顯的凈化效果，處理組水體中的氨氮、亞硝酸鹽、硝酸鹽及有害弧菌數均顯著低于對照組。LIANG等［27］將地衣芽孢桿菌應用到草魚（Ctenopharyngodonidellus）水體治理中，亞硝酸鹽含量較對照組降低88.8%，硝酸鹽降低72.37%，總氮降低35.95%，但是氨氮含量卻較對照組有所增加。芽孢桿菌能夠分泌多種胞外活性物質，抑制有害藻菌滋生，提高動物免疫力［28－29］。張睿等［29］認為，枯草芽孢桿菌可以通過直接接觸、分泌胞外活性物質及營養資源競爭等多種方式抑制微囊藻等有害微藻的增殖。關于芽孢桿菌和微藻之間的關系，JI等［30］作了更深入的機理研究，發現當小球藻和地衣芽孢桿菌按比例（1∶3）共存時，環二鳥苷酸（c di GMP）和自動誘導胎（AIP）濃度最高，細胞間的粘附作用增強，藻菌細胞間的信號交流最為頻繁，且小球藻細胞干重、葉綠素相關基因及細菌rRNA的拷貝數最高，其對模擬養殖尾水中的溶解性COD（sCOD）、溶解性總磷（TDP）、溶解性總氮（TDN）的去除率皆顯著高于同比例下的銅綠微囊藻和地衣芽孢桿菌組合，而在后者組合中未發現藻菌細胞間的粘附作用。該實驗結果證明地衣芽孢桿菌和小球藻共存時，二者之間不存在消耗和破壞，c di GMP和AIP濃度的增加促進了藻菌細胞群的形成。由此可見，芽孢桿菌對微藻的抑制和破壞作用可能僅針對有毒有害微藻。

光合細菌是指一類在厭氧條件下進行不放氧光合作用的細菌。光合細菌能夠利用光能同化CO2，固定無機氮，同時對水體底層的有機物進行分解，產生有機酸、硫化氫和氨等合成菌體的基礎物質，從而實現對水體的凈化［31］。ZHANG等［32］探究了PSB對草魚養殖水體水質及其微生物的結構和多樣性的影響。結果表明，加菌處理組水體中各態氮的含量都顯著低于對照組，其中氨氮、亞硝酸鹽及硝酸鹽的最大去除率分別為80.92%、94.90%、29.81%，且處理組擁有較高的微生物多樣性和結構復雜性。陸家昌等［33］用PSB處理凡納濱對蝦（Litopenaeusvannamei）養殖水體，結果發現當PSB投菌濃度為3×103個·mL－1時，水體中的COD、氨氮和亞硝酸鹽含量分 別 比 對 照 組 降 低31.59%、43.42%和52.20%，且凡納濱對蝦的抗氧化酶活性及其他生理指標都達到最佳效果，顯著提高了凡納濱對蝦抗病能力。PSB分解吸收水體中污染物進行自身增殖的同時，還可以有效控制水中的病原微生物和浮游藻類的大量增殖。鄭亞君等［34］將光合細菌接種至富營養化水體，總氮和總磷分別降低了76%和30%，且有效控制了水體中藍藻和綠藻的生物量。在一定條件下，光合細菌對弧菌具有抑制作用［35］。為了探究不同狀態光合細菌凈水能力的差異性，劉毅等［36］將懸浮態和固定化PSB的凈水效果作了比較，結果證明固定化PSB對對蝦養殖尾水具有更好的凈化效果。光合細菌自身生長受環境影響較大，所以其分解代謝污染物的能力也會隨環境條件的變化而變化。ZHI等［37］研究了不同光暗循環下，PSB的生長代謝和水質凈化情況，在24 h光暗循環條件下，PSB生物量最高，氨氮去除率為48%，顯著高于其他組；3 h循環時，蛋白質和輔酶Q60濃度最高；不同循環下廢水中COD和TP去除效果差異不明顯。固氮紅細菌適應性強，在不同碳源影響下均可有效去除無機三態氮，可作為養殖水體治理的優先選擇［38］。

硝化細菌是一種化能自養菌，包括亞硝酸細菌和硝酸細菌。該菌以CO2作為唯一碳源，通過硝化作用氧化無機氮化合物獲取能量，合成有機物，以供自身代謝所需。硝化細菌通過硝化作用，將氨氮和亞硝酸鹽轉化成硝酸鹽，然后在反硝化細菌的配合下，將無機氮化合物轉化為N2釋放。SHAN和OBBARD［39］研究發現，硝化細菌處理組氨氮含量顯著低于對照組，并在第5天降為0 mg·L－1，硝酸鹽含量則從第5天開始呈現上升趨勢，說明該硝化細菌進行硝化作用將氨氮轉化為硝酸鹽。硝化細菌屬于化能自養細菌，無法分解水體中的有機污染物。高金偉等［40］基于此對硝化細菌的凈化能力和枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）進行比較，發現二者對氨氮和亞硝態氮皆有很好的去除效果，前者去除COD效果不明顯。不同狀態硝化細菌的脫氮能力有所不同，槐創鋒和陳華［41］對粉末狀和濃縮液態硝化細菌的脫氮效果進行比較，證明二者對水質皆有顯著凈化效果，粉末狀菌株效果更優，其氨氮去除率高達95%，亞硝酸鹽去除率接近100%。

芽孢桿菌、PSB和硝化細菌等應用較為廣泛，但弊端明顯。芽孢桿菌代謝好氧，增殖過度會引起水體缺氧；PSB的使用對水環境條件要求較為苛刻，且容易被浮游動物捕食；硝化細菌生長緩慢，平均世代時間在10 h以上，易受外界環境影響，培養難度大［42］。因此，為了尋找更合適的菌種，其他新生代益生菌也漸漸受到重視（表1）。由 表1可 知，有 效 微 生 物 群（effective microorganisms，EM）、酵母菌（Saccharomyces）以及乳酸菌（Lactobacillus）逐步成為研究重點，而且對養殖水體凈化效果顯著。

表1 其他益生菌對養殖水體中各態氮磷的去除情況Tab.1 Removal of nitrogen and phosphorus in aquaculture water by other probiotics

3.2 復合菌作用效果研究

單菌種凈水研究比較多，但存在較多不足。單一菌種在養殖水體的增殖容易受其他微生物或者水環境的制約，且不同菌種對不同氮磷化合物的去除能力差異明顯，所以采用單菌種進行水質調控具有很大局限性。復合菌可以通過菌種間互利共生關系組成穩定的生態微系統，系統內菌種協同配合，提高環境耐受性的同時有效降低水體中各態污染物，凈水效果大大優于單菌種作用［49］。徐 帥 琳［50］對 沼 澤 紅 假 單 胞 菌（Rhodopseudomonaspalustris）、枯草芽孢桿菌和細黃鏈霉菌（Streptomycesmicroflavus）3種微生物制劑的脫氮效果進行了探究，結果顯示3株菌對氨氮都有很高的去除率，沼澤紅假單胞菌最高為94.3%，其次是枯草芽孢桿菌72.9%以及細黃鏈霉菌71.9%。而將3株菌按比例混合接種對氨氮和亞硝態氮去除率高達99.6%和94%，效果大大優于單菌或雙菌作用，證明了復合菌株的優勢。JANEO等［51］將含有多種益生菌、脂肪酶和蛋白酶的生物增強劑應用于斑節對蝦（Penaeus monodon）的養殖中，發現其能夠有效改善養殖水質和微生物結構，且對斑節對蝦的生長起正向促進作用。康傳磊等［52］研究了3株異養硝化 好氧反硝化細菌對圓斑星鰈（Veraspervariegates）養殖水質的凈化效果，3株菌分別是花津灘芽孢桿菌（Bacillus hwajinpoensis）、嗜 堿 鹽 單 胞 菌（Halomonasalkaliphila）和麥氏交替單胞菌（Alteromonasmacleodii）。結果顯示，3菌株混合處理組凈水效果最佳，雙菌組合次之，單菌作用效果最差，且實驗菌株對圓斑星鰈無毒害和副作用。宋協法等［43］以生物膜法為基礎，以枯草芽孢桿菌、酵母菌、乳酸菌為實驗對象，研究了單菌及混合菌作用時凈水效果的差異，結果顯示3菌株處理組氨氮和亞硝態氮去除率均達90%以上，COD去除率接近77%，顯著高于單菌株處理組和對照組。綜上可見，復合菌株能相互補足，提高對環境的適應能力，在水質調控方面具有單菌株無法替代的優勢。

3.3 益生菌和浮游植物共同作用效果研究

微藻和水生植物是自然界的第一生產者，通過光合作用固定CO2，釋放氧氣，并吸收水體中氮磷元素合成有機物。而細菌作為分解者，能夠利用植物所釋放的氧氣來進行自身的分解代謝活動，將水體中的有機物分解成無機物，再被植物吸收利用，實現代謝方面的互補（圖2）［53］。劉娥等［42］以蛋白核小球藻（Chlorellapyrenoidesa）和PSB為研究對象，探討了固定化菌藻的凈水效果。結果顯示，固定化菌藻對氮和磷的去除率高達95%和84%，顯著高于單菌或單藻作用。因此，合理的固定和使用菌藻結合體可顯著提高對養殖廢水的凈化效率。共生菌藻在生長過程中，彼此會分泌一些胞外產物來促進對方的生長。細菌會分泌類維生素物質、分解有機質的酶類以及促進微藻生長的糖肽類物質；而微藻主要分泌溶解態氨基酸，用以刺激細菌的生長［54］。陳書秀和王偉偉［55］研究發現，EM菌能夠促進硅藻、金藻和綠藻的生長，其中對金藻和硅藻的促生長作用更加明顯，生長率可提高20%～50%。GOMEZ GIL等［56］將牟氏角毛藻（ChaetocerosMuelleri）和解藻酸弧菌C7b（VibrioalginolyticusC7b）共培養時發現，解藻酸弧菌C7b增殖迅速，9 d內始終保持穩定的高濃度，而當該菌株單獨進行培養時，其菌株濃度很快開始降低。由此可見，形成共生關系的菌藻會促進彼此的生長，繼而增加對水體中污染物的分解和吸收，凈化效果會顯著優于菌藻單獨作用。

圖2 菌藻共生關系圖Fig.2 Picture of symbiotic relationship between bacteria and algae

除菌藻組合以外，益生菌和大型水生植物協同作用治理廢水也是研究的熱點之一。大型水生植物通過光合作用來吸收無機物以轉化為有機物，并釋放氧氣，供益生菌利用。水生植物在生長的過程中，在其根系附近會形成好氧微環境，并附著大量微生物，間接促進植物和微生物的 生 長 代 謝［57］。許 國 晶 等［58］將 水 葫 蘆（Eichhorniacrassipes）與EM菌組合應用于養殖水環境改善中，其對氨氮、亞硝態氮、TN和TP以及COD的去除率分別為81.82%、89.8%、40.35%、73.81%和55.91%，顯著高于EM菌處理組以及對照組。集約化養殖水體經該協同體系凈化處理之后，TN、TP水平降至淡水養殖池塘排放水一級標準，NH4＋ N水平降至0.6 mg·L－1以下，NO2－ N水平則降至0.1 mg·L－1以下。康銀等［59］作 了 類 似 的 研 究，將EM菌 和 水 雍 菜（Ipomoeaaquatica）共同作用于草魚養殖水體，高效脫氮除磷的同時，增加水雍菜的產量，實現了經濟與生態的雙重效益。

4 問題和展望

綜上所述，益生菌不僅可以分解有機物使其轉化為無機物，且對氨氮、亞硝態氮等無機污染物同樣具有高效吸收能力。此外，益生菌能夠抑制水體中有害菌藻的大量增殖，優化微生物群落結構，減少水產疾病的發生。利用益生菌進行養殖水環境調控符合水產養殖可持續健康發展的要求。但是，目前關于益生菌的研究還不夠深入，仍然存在很多急需解決的問題。首先，單菌株凈水作用機理研究較多，而關于復合菌株和菌藻之間的協同作用機理尚不清楚。其次，復合菌或菌藻進行養殖水質調控，效果明顯優于單菌株作用，但是各微生物之間的最佳配比以及用量用法還不能確定，現有的研究僅僅停留在實驗室層面，無法進行大規模應用。再次，除光合細菌、芽孢桿菌等常用益生菌外，新生代益生菌品種開發不足，而且部分新開發菌株的安全性有待考究。最后，益生菌的發酵生長跟其所處環境密切相關，自然環境變化限制其凈水能力的發揮，目前高環境耐受性和廣譜適應性菌株較為缺乏。因此，在益生菌未來的研究當中，應該從以下幾點出發：

1）開發具有特定功能的轉基因工程微生物，使其具有高環境耐受性和全面有效降解污染物的能力；

2）著重分離篩選天然漁業水域中固有的益生菌株，并對已篩選的天然菌株進行安全性驗證；

3）加強對復合菌、菌藻之間的協同作用機理和最佳配比研究，篩選出最合適的菌菌或菌藻組合并對其實用性進行考究。

4）選用具有高營養價值和高凈水效率的菌株進行水環境調控研究，菌株增殖后可直接作為水產動物的生物餌料，降低菌液分離的成本，兼顧生態和經濟雙重效益。

盡管在益生菌的研究和應用中存在諸多問題，但其仍然受到養殖從業者的青睞。相信隨著科學的發展和微生物領域研究的不斷深入，這些問題都會迎刃而解。可以預見，益生菌應用前景極其廣闊，將會給水產養殖業帶來巨大的經濟效益和社會效益。