基于“適應(yīng)原樣”作用的人參碳量子點(diǎn)膠體對(duì)小鼠抑瘤作用研究和抗COVID-19臨床應(yīng)用

張喜武，田瑩瑩，李秋晗，2，白玉峰，朱瑜，竇金金

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江省康效中醫(yī)藥研究有限公司，黑龍江 哈爾濱 150040；3.哈爾濱成程生命與物質(zhì)研究所，黑龍江 哈爾濱 150500；4.哈爾濱團(tuán)簇現(xiàn)代中醫(yī)健康服務(wù)有限公司，黑龍江 哈爾濱 150500；5.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

新型冠狀病毒肺炎(Corona Virus Disease 2019,COVID-19)具有高度的傳染性，除人與人傳染外，更體現(xiàn)在機(jī)體臟腑之間的傳染，最終導(dǎo)致多臟器受損甚至臟器衰竭，基于此,可運(yùn)用五臟同補(bǔ)的中藥或者方劑進(jìn)行治療，達(dá)到對(duì)癥治療的目的。人參為“百草之王”，是一種滋補(bǔ)強(qiáng)壯的藥物，2015版《中國(guó)藥典》記載，人參具有大補(bǔ)元?dú)狻⑸蚬贪l(fā)、補(bǔ)脾益肺、安神益智等功效，《神農(nóng)本草經(jīng)》中記載，人參具有“主補(bǔ)五臟……除邪氣……”的功效，如生脈散可用于新型冠狀病毒肺炎恢復(fù)期治療[1]。

G-CQDS是以人參根為原料，采用超音速對(duì)撞粉碎和光電碳化技術(shù)，制備成人參碳量子點(diǎn)膠體，因其碳化集聚可負(fù)載大量電荷，能夠進(jìn)一步提高人參“適應(yīng)原樣”作用。G-CQDS已在市場(chǎng)應(yīng)用5年之多，具有較強(qiáng)抗腫瘤和提高免疫力作用，現(xiàn)已被黑龍江省科技廳列入創(chuàng)新產(chǎn)品目錄。在疫情期間，積極響應(yīng)國(guó)家號(hào)召，為多家社區(qū)免費(fèi)贈(zèng)送了大量的G-CQDS，旨在提高人體免疫力，降低被COVID-19傳染的風(fēng)險(xiǎn)，依據(jù)使用跟蹤表統(tǒng)計(jì)結(jié)果，目前使用該產(chǎn)品的人群中未有被COVID-19感染者。由于疫情等多因素限制，目前應(yīng)用到COVID-19確診患者僅有2例，分別為何某某(女，武漢人，被武漢市第四醫(yī)院(古田醫(yī)院)收治，連續(xù)服用6 d，核酸檢測(cè)陰性出院)和李某某(男，武漢人，被武漢市中醫(yī)醫(yī)院收治，連續(xù)服用7 d，治愈出院)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

1.1 材料

SPF級(jí)ICR小鼠90只，18～22 g，雄性，購(gòu)于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證號(hào):SYXK(黑)2015-003。NCI-H1975肺癌細(xì)胞，由中國(guó)科學(xué)院干細(xì)胞庫(kù)提供。

1.2 試藥

G-CQDS溶液(生命波人參根飲液：201811190802，95 mL)，由哈爾濱團(tuán)簇現(xiàn)代中醫(yī)健康服務(wù)有限公司提供，吉非替尼(181101，0.25 g)，購(gòu)自阿斯利康制藥有限公司。

1.3 試劑及儀器

RPMI-1640培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)；胎牛血清(美國(guó)Hyclone公司)；胰蛋白酶(美國(guó)Hyclone公司)；雙抗(美國(guó)Hyclone公司)；磷酸鹽緩沖液PBS(北京Biotopped公司)；4%臺(tái)盼藍(lán)(北京雷根生物技術(shù)有限公司)；IL-6 、TNF-α酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；不銹鋼數(shù)顯卡尺(上海尺喜工量具有限公司)；低速離心機(jī)，型號(hào)：SC-04(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司)；二氧化碳培養(yǎng)箱，型號(hào)：HF90(上海力申科學(xué)儀器有限公司)；超凈臺(tái)，型號(hào)：BIOsafe12(上海力申科學(xué)儀器有限公司)；倒置顯微鏡，型號(hào)：CKX41SF(美國(guó)Philippines公司)。超音速對(duì)撞粉碎儀器(哈爾濱成程生命與物質(zhì)研究所自制)，光電碳化儀器(哈爾濱成程生命與物質(zhì)研究所自制)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物模型復(fù)制

60只SPF級(jí)ICR雄性小鼠皮下注射接種細(xì)胞懸液0.1 mL，即每只小鼠接種細(xì)胞數(shù)為5×106個(gè)/只。空白對(duì)照組10只SPF級(jí)ICR雄性小鼠皮下注射PBS磷酸鹽緩沖液 0.1 mL。

2.2 G-CQDS溶液制備與表征

將超音速對(duì)撞粉碎儀器氮?dú)饬魉僭O(shè)置為600 m/s，超高速對(duì)撞1～2次，將人參根(≤5年生)瞬間粉碎成超細(xì)粉末。將粉末與水混合后在光電碳化儀器進(jìn)行加熱，溫度為120 ℃，人參粉末和水的質(zhì)量比為1∶10，加熱時(shí)間為180 s，遠(yuǎn)紅外線照射速度30/s，使其全部碳化分散于水中形成碳量子點(diǎn)膠體溶液。碳量子點(diǎn)顆粒通過JEM-2100型透射電鏡進(jìn)行觀察，測(cè)定其外觀形態(tài)和粒徑大小。采用Nicolet 6700型傅立葉變換紅外光譜儀測(cè)試光譜，評(píng)估碳量子點(diǎn)的光學(xué)性質(zhì)，采用熒光光譜儀(F-7000)，測(cè)定熒光發(fā)射光譜圖。

2.3 動(dòng)物分組及給藥

建模后小鼠隨機(jī)分為G-CQDS治療組、吉非替尼組、模型組，每組20只；空白組10只，G-CQDS預(yù)防組20只。G-CQDS治療組以30倍濃縮(相當(dāng)于人每天飲用24瓶)的飲液9.88 mL/(kg·d)灌胃；吉非替尼組0.032 5 g/(kg·d)灌胃；模型組、空白組以純凈水灌胃，灌胃劑量均為0.2 mL，連續(xù)灌胃18 d；G-CQDS預(yù)防組提前給藥34 d，劑量同給藥組，第35天皮下接種肺癌細(xì)胞懸液，繼續(xù)給藥。

2.4 考察指標(biāo)

2.4.1 外觀觀察

觀察各組小鼠健康狀況、精神狀態(tài)、食欲、運(yùn)動(dòng)、毛發(fā)、大便及腫瘤生長(zhǎng)情況等。

2.4.2 腫瘤體積

每天測(cè)量腫瘤體積(TV),其中a為長(zhǎng)徑，b為短徑，腫瘤體積計(jì)算公式為腫瘤體積=1/2ab2。

2.4.3 相對(duì)腫瘤增殖率

各組根據(jù)腫瘤體積計(jì)算相對(duì)腫瘤體積RTV=Vt/V0，其中V0為分組給藥前(即d0)的腫瘤體積，Vt為每次測(cè)量時(shí)的腫瘤體積。抑瘤活性的評(píng)價(jià)指標(biāo)為相對(duì)腫瘤增殖率(T/C)，即給藥組RTV與模型對(duì)照組RTV比值的百分比，T/C>60%為無(wú)效，≤60%并經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理P<0.05為有效。相對(duì)腫瘤增殖率=TRTV/CRTV×100%。

2.4.4 體質(zhì)量、胸腺指數(shù)及脾指數(shù)

稱量小鼠給藥前(即d0)的體質(zhì)量及最后一次給藥后的體質(zhì)量。最后一次給藥后，禁食不禁水，次日將小鼠摘眼球取血，處死，解剖，剝離胸腺、脾臟，稱重，計(jì)算胸腺指數(shù)及脾指數(shù)。胸腺指數(shù)=[小鼠胸腺重量(mg)/小鼠體質(zhì)量(g)]×10；脾指數(shù)=[小鼠脾臟重量(mg)/小鼠體質(zhì)量(g)]×10。

2.4.5 細(xì)胞因子IL-6、TNF-α

小鼠摘眼球取血，血靜置1～2 h，離心，取血清,采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測(cè)定每組小鼠血清中IL-6(白細(xì)胞介素6)，采用競(jìng)爭(zhēng)法(ELISA)檢測(cè)腫瘤壞死因子(TNF-α)的含量。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 G-CQDS的制備與表征結(jié)果

高分辨電鏡照片顯示碳顆粒為無(wú)內(nèi)部缺陷的完整晶體，碳量子點(diǎn)呈類球形單分散，直徑約為2～5 nm，見圖1a。圖1b為碳量子點(diǎn)的傅里葉紅外光譜，圖中3 439 cm-1處為羥基(-OH)的伸縮振動(dòng)峰；2 923 cm-1與1443 cm-1處是C-H的特征吸收峰；1 725 cm-1處為C=O的伸縮振動(dòng)峰；1 235 cm-1處的吸收峰表明存在C-O官能團(tuán)；860 cm-1處表示存在C-C的伸縮振動(dòng)；625 cm-1處表示可能有C-CO-C彎曲振動(dòng)。圖1c為激發(fā)光波長(zhǎng)不變情況下碳量子點(diǎn)的Emission Wavelength發(fā)射光譜，測(cè)定樣品發(fā)射出不同波長(zhǎng)的熒光，波長(zhǎng)為橫坐標(biāo)，以其強(qiáng)度F為縱坐標(biāo)作圖，325 nm激發(fā)波長(zhǎng)下碳原子團(tuán)簇/納米碳的熒光光譜，在325 nm激發(fā)波長(zhǎng)下的熒光最大發(fā)射波長(zhǎng)約為440 nm。圖1d為保持熒光發(fā)射波長(zhǎng)不變碳原子團(tuán)簇/納米碳Excitation Wavelength激發(fā)光譜，400 nm發(fā)射波長(zhǎng)下納米顆粒的激發(fā)光譜，在400 nm發(fā)射波長(zhǎng)下最大激發(fā)波長(zhǎng)約為470 nm，說明納米顆粒表面含有較多-OH和-COOH。

圖1 a為采用水熱法制備的G-CQDS透射電鏡照片;b為石墨脈沖激光輻照制備的人參碳碳量子點(diǎn)膠體紅外吸收光譜(傅里葉紅外光譜);c為水熱法法制備的G-CQDS Emission Wavelength發(fā)射光譜;d為水熱法制備G-CQDS Excitation Wavelength激發(fā)光譜

3.2 外觀觀察結(jié)果

觀察小鼠外觀及生存狀態(tài)，G-CQDS治療組及預(yù)防組較模型組瘤體小，活潑好動(dòng)，精神狀態(tài)良好，食欲良好，毛發(fā)光澤，大便性狀未見異常；吉非替尼組小鼠瘤體小，行動(dòng)遲緩、不活潑，食欲欠佳，毛發(fā)暗淡無(wú)光澤；模型組與給藥組相比，瘤體較大；空白組小鼠健康狀況及精神狀態(tài)良好，食欲佳，行動(dòng)靈活。

3.3 腫瘤體積(TV)結(jié)果

表1 各實(shí)驗(yàn)組小鼠腫瘤體積

各組小鼠腫瘤體積如表1所示，吉非替尼和G-CQDS治療組腫瘤體積較模型組顯著減小，隨著給藥天數(shù)的增加，腫瘤體積先增大后減小。建模小鼠成瘤率100%，G-CQDS預(yù)防組小鼠成瘤率為35%。

3.4 相對(duì)腫瘤增殖率(T/C)結(jié)果

表2 各實(shí)驗(yàn)組小鼠相對(duì)腫瘤增殖率的影響

G-CQDS治療組給藥10～13 d的相對(duì)腫瘤增殖率分別為57.24%、55.00%、28.14%、17.93%，均<60%，吉非替尼組給藥第13天相對(duì)腫瘤增殖率達(dá)到38.65%。見表2。

3.5 體質(zhì)量、胸腺指數(shù)及脾指數(shù)結(jié)果

小鼠給藥前后體質(zhì)量的變化如表3所示，G-CQDS治療組體質(zhì)量增長(zhǎng)量與模型組一致，說明G-CQDS對(duì)小鼠體質(zhì)量無(wú)影響；吉非替尼組體質(zhì)量變化比模型組小，可能與吉非替尼影響小鼠食欲有關(guān)；G-CQDS預(yù)防組體質(zhì)量變化大，原因可能與給藥周期較長(zhǎng)有關(guān)。

表3 各實(shí)驗(yàn)組小鼠體質(zhì)量、胸腺指數(shù)、脾指數(shù)的影響

小鼠胸腺指數(shù)、脾指數(shù)的測(cè)定如表3所示，吉非替尼組較模型組明顯降低胸腺指數(shù)和脾指數(shù)，其中脾指數(shù)更為顯著；G-CQDS治療組對(duì)小鼠脾指數(shù)的影響較大，G-CQDS預(yù)防組與模型組比較均能降低胸腺指數(shù)和脾指數(shù)(P<0.01)。

3.6 細(xì)胞因子IL-6、TNF-α檢測(cè)結(jié)果

表4 各實(shí)驗(yàn)組小鼠IL-6、TNF-α的影響

試劑盒檢測(cè)結(jié)果顯示，G-CQDS預(yù)防組可以顯著降低IL-6的含量，吉非替尼、G-CQDS治療組及預(yù)防組與模型組比較均可升高TNF-α的含量，從而達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用。見表4。

4 結(jié)論

G-CQDS治療組與模型組比較腫瘤體積明顯減小，給藥第10天起相對(duì)腫瘤增殖率<60%，證明G-CQDS具有抗腫瘤作用，且起效速度較快。預(yù)防組成瘤率顯著降低，且預(yù)防組顯示出更好的療效，證實(shí)G-CQDS可以有效預(yù)防腫瘤形成。能明顯降低胸腺指數(shù)和脾指數(shù)，可能通過調(diào)節(jié)小鼠免疫功能達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)的目的。G-CQDS治療組與預(yù)防組對(duì)小鼠外觀和生存狀態(tài)無(wú)任何不良影響，而吉非替尼陽(yáng)性對(duì)照組對(duì)模型小鼠外觀和生存狀態(tài)影響較大，推測(cè)是由吉非替尼副作用導(dǎo)致的[2-3]。

人參具有“適應(yīng)原樣”作用，能夠增強(qiáng)機(jī)體對(duì)有害因素的抵抗力。臨床中醫(yī)專家認(rèn)為患者熱退后往往存在疲倦、舌少津等癥狀，表現(xiàn)為氣陰兩虛證，與眾多專家意見相同[4]，提示新冠肺炎患者核酸檢測(cè)陰性出院后，仍要繼續(xù)服用人參產(chǎn)品，盡快恢復(fù)新冠肺炎對(duì)身體造成的損傷。

超音速對(duì)撞粉碎和光電碳化儀器是由哈爾濱成程生命與物質(zhì)研究所和北京航空航天大學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室合作自主研發(fā)并制造，其技術(shù)水平為國(guó)內(nèi)領(lǐng)先，共耗資幾千萬(wàn)元人民幣。超音速對(duì)撞技術(shù)采用高壓氣體和高速離心加速，將中藥粗顆粒以600 m/s的速度相向?qū)ψ玻蛊淦扑槌稍踊蚍肿訄F(tuán)簇(小于5 mm)，懸浮在水溶液中。光電碳化技術(shù)是高壓放電產(chǎn)生的等離子體(弧光或閃電)作用在懸浮于水溶液中的團(tuán)簇，使其碳化制成碳量子點(diǎn)溶膠的過程(直徑約為2～5 nm)。 碳量子點(diǎn)(CQDS)是近來出現(xiàn)碳納米材料家族的新成員，由于其有熒光穩(wěn)定性高且耐光漂白、激發(fā)光寬而連續(xù)、有水溶性好及在細(xì)胞中遷移快等特性，被認(rèn)為是一種理想的生物醫(yī)用材料[5]。最新研究發(fā)現(xiàn)碳量子點(diǎn)具有提高T細(xì)胞能力以及誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞、骨肉瘤細(xì)胞凋亡的現(xiàn)象[6-9]，將傳統(tǒng)中藥制備成以碳量子點(diǎn)形式給藥，可大大能夠提高臨床療效。