伸筋草總生物堿的提取純化與急性毒性及抗炎活性研究

張妍妍，畢悅，尹麗穎，牛雯穎，肖洪彬

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

伸筋草為石松科植物石松LycopodiumjaponicumThunb.的干燥全草，在我國大部分地區(qū)均有分布，其味微苦、溫、辛，歸于肝、腎、脾經(jīng)，具有祛風(fēng)除濕、舒筋活絡(luò)等功效[1]。伸筋草中含有豐富的生物堿類成分，還含有三萜類、黃酮類、揮發(fā)油等其他成分[2]，現(xiàn)代藥理研究表明，其具有消炎、鎮(zhèn)痛、抗菌、抑制乙酰膽堿酯酶活性、抗血小板凝集、調(diào)節(jié)免疫及抗氧化作用等多重藥理作用[3-5]。多年來臨床實踐證實，伸筋草用于類風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)增生性膝關(guān)節(jié)炎、創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)炎等的治療效果確切，然而關(guān)于伸筋草抗炎抗風(fēng)濕的藥物作用機制報道較少，且缺乏針對性的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究和毒理研究，影響了藥物的進一步開發(fā)與應(yīng)用。本研究旨在對伸筋草總生物堿成分的急性毒性及抗炎活性進行研究，為伸筋草藥用資源的有效充分利用提供新的理論依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 試驗藥品

伸筋草藥材由哈藥集團世一堂中藥飲片有限責(zé)任公司提供，并經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實驗實訓(xùn)中心中藥形態(tài)實驗室鑒定為石松科植物石松LycopodiumjaponicumThunb.的干燥全草。苦參堿對照品，購自于中國食品藥品檢定研究院，批號110805-201709。雷公藤多苷片，購自于遠大醫(yī)藥黃石飛云制藥有限公司，規(guī)格：10 mg/片，批號：20170301，用羧甲基纖維素鈉配制成雷公藤多苷-CMC混懸液2.5 mg/mL。

1.2 試驗動物

SPF級小鼠，體質(zhì)量(20±2)g，實驗動物許可證號：SYXK(黑)-2017-011， SPF級SD大鼠，體質(zhì)量(200±20)g，實驗動物許可證號：SCXK(吉)-2018-0007，均由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)GLP實驗動物中心提供，在(25±2)℃下飼養(yǎng)，光照12 h/12 h明暗自動切換(7:00-19:00)，自由飲水采食，經(jīng)檢查判斷為健康后用于試驗。

1.3 儀器及試劑

001x7型強酸性陽離子交換樹脂(河北森納特化工有限公司)；Agilent 8453紫外-可見分光光度計(美國安捷倫科技有限公司)；IKA MVP 10基本型真空泵(艾卡廣州儀器設(shè)備有限公司)；101-2A電熱鼓風(fēng)干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司)。弗氏完全佐劑(批號：1002036152，西格瑪公司)，水為雙蒸水，其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

2 方法

2.1 伸筋草總生物堿的提取純化與含量測定

2.1.1 伸筋草總生物堿的提取純化

采用陽離子交換樹脂法提取純化伸筋草中的總生物堿成分[6]。取伸筋草藥材500 g，烘干后粉碎成粗粉，加入0.2%的鹽酸溶液滲漉提取，滲漉液經(jīng)調(diào)pH值(pH=7.4)進行梯度沉淀，過濾，濾液上001×7陽離子交換樹脂柱，流速3 BV/h，水洗至流出液中性，用5%的氨水洗脫樹脂，洗脫液減壓回收至膏狀，烘干，即得伸筋草總生物堿提取物。

2.1.2 伸筋草總生物堿的含量測定

對照品溶液的制備：精密稱取5 mg苦參堿對照品，置于100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成每1 mL含0.05 mg的苦參堿對照品溶液。

樣品溶液的制備：精密稱取10 mg伸筋草總生物堿干燥提取物，置于10 mL量瓶中，加甲醇超聲溶解，并定容至刻度，即得。

樣品中總生物堿含量的測定方法: 采用酸性染料比色法[7]，測定提取物中總生物堿的含量，精密量取樣品溶液3 份，每份0.5 mL，分別置于分液漏斗中，依次分別加入pH 4.0的鄰苯二甲酸氫鉀緩沖液5 mL、三氯甲烷5 mL和溴甲酚綠溶液2 mL，振搖2 min，靜置分層，取三氯甲烷層，在425 nm處測定吸光度。

2.1.3 線性范圍考察

分別精密量取0.2、0.6、0.8、1.2、2.0 mL對照品溶液，置于分液漏斗中，同樣品溶液的處理方法，依次加入pH 4.0的鄰苯二甲酸氫鉀緩沖液5 mL、三氯甲烷5 mL和溴甲酚綠溶液2 mL，振搖2 min，靜置分層，取三氯甲烷層，在425 nm處測定吸光度。不加對照品，以空白溶劑同法處理為空白對照，所得三氯甲烷溶液，在425 nm處測定吸光度。以苦參堿對照品的質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)，吸光度(Y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.1.4 精密度試驗

精密量取0.2 mL對照品溶液，同樣品溶液的處理方法，所得三氯甲烷待測液，在425 nm處測定吸光度，連續(xù)測定5次，計算吸光度的RSD值。

2.1.5 重復(fù)性試驗

精密量取樣品溶液6份，每份0.5 mL，同樣品溶液的處理方法，制得6份三氯甲烷待測液，在425 nm處測定吸光度，計算含量及RSD值。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗

精密量取0.5 mL樣品溶液，同樣品溶液的處理方法，制得三氯甲烷待測液，室溫放置0、2、4、6、8 h時，分別在425 nm處測定吸光度，計算不同放置時間的RSD值。

2.1.7 加樣回收率試驗

精密量取樣品溶液5份，每份0.5 mL， 分別加入0.2 mL對照品溶液，同樣品溶液的處理方法，制得三氯甲烷待測液，在425 nm處測定吸光度，計算加樣回收率及RSD值。

2.2 伸筋草總生物堿的急性毒性試驗

取SPF級小鼠60只，隨機分為6個組，1組為正常對照組，其余5組為伸筋草總生物堿提取物不同劑量給藥組，每組均為10只，雌雄各半。參考預(yù)試驗結(jié)果，設(shè)置小鼠的5個給藥劑量分別為1.38、2.07、2.76、3.45、4.14 g/kg(以總生物堿提取物量計)，給藥體積均為25 mL/kg。依次取相應(yīng)量的伸筋草總生物堿提取物溶于水，小鼠經(jīng)口一次性灌胃，正常對照組小鼠灌胃等體積生理鹽水，灌胃前12 h、灌胃后4 h均禁食，自由飲水，灌胃后連續(xù)觀察14 d，記錄小鼠的毒性反應(yīng)和死亡情況，14 d后處死所有小鼠，肉眼觀察心、肝、脾、胃、腎等主要臟器的變化，如發(fā)現(xiàn)病變情況則需要進行病理組織形態(tài)學(xué)檢查。

2.3 伸筋草總生物堿的抗炎活性研究

2.3.1 弗氏完全佐劑致大鼠足跖腫脹試驗

取SPF級SD大鼠60只，隨機分為6個組，分別為正常對照組、模型組、雷公藤多苷陽性對照組(5.40 mg/kg)、伸筋草總生物堿提取物高劑量組(19.80 mg/kg)、伸筋草總生物堿提取物中劑量組(12.38 mg/kg)、伸筋草總生物堿提取物低劑量組(4.95 mg/kg)，每組均為10只，雌雄各半。正常對照組10只大鼠右后足跖皮下注射生理鹽水0.15 mL，其余各組大鼠同法皮下注射等量弗氏完全佐劑，誘導(dǎo)佐劑型關(guān)節(jié)炎(Adjuvant-induced arthritis，AA)大鼠模型[8]。于造模后第10 d，以手術(shù)線環(huán)繞右后足跖部相應(yīng)部位測量周長。測量后開始分組灌胃給藥，每日1次，給藥體積均為10 mL/kg，正常對照組和模型組同法給予等體積生理鹽水，連續(xù)給藥14 d。末次給藥后2 h，同法再次測量右后足跖部周長，計算足跖腫脹改善率。足跖腫脹改善率(%)=(給藥前大鼠右后足跖部周長-給藥后大鼠右后足跖部周長)/ 給藥前大鼠右后足跖部周長。

2.3.2 大鼠棉球肉芽腫增生試驗

取SPF級SD大鼠50只，除去正常對照組，其余分組和給藥劑量均同“2.3.1”項下方法。將各組大鼠以水合氯醛麻醉，在無菌條件下于腹股溝處植入一個50 mg的滅菌干棉球[9]，待大鼠當(dāng)天清醒后開始灌胃給藥，每日1次，模型組同法給予等體積生理鹽水，連續(xù)給藥14 d。末次給藥后2 h，處死大鼠并取出棉球肉芽腫組織，置于60 ℃烘箱中，干燥24 h后取出稱重，即為棉球肉芽腫質(zhì)量。肉芽腫質(zhì)量=棉球肉芽腫質(zhì)量-原干棉球質(zhì)量。

2.4 統(tǒng)計分析

應(yīng)用SPSS 21.0軟件包進行數(shù)據(jù)的處理統(tǒng)計，對符合正態(tài)分布的多組間均值比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，方差齊性時采用LSD法，方差不齊時采用Dunnett'sT3法，數(shù)據(jù)結(jié)果均以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，P<0.05顯示為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；急性毒性實驗采用半數(shù)致死量(LD50)Bliss法進行數(shù)據(jù)處理。

3 結(jié)果

3.1 伸筋草總生物堿的提取純化與含量測定結(jié)果

500 g伸筋草藥材共提取純化制得伸筋草總生物堿提取物92 g，提取率為18.4%。所得苦參堿的線性回歸方程為：Y=396.68X+401.41(R2=0.999 2)，線性范圍為1.9～14.3 μg/mL，表明苦參堿對照品與吸光度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。精密度試驗結(jié)果顯示，苦參堿對照品連續(xù)測定5次吸光度的RSD值為0.86%，表明測定儀器的精密度良好。重復(fù)性試驗結(jié)果顯示，同法制得的5份樣品待測液中的總生物堿含量分別為2.75、2.68、2.76、2.80、2.79 μg/mL，計算RSD值為1.71%，表明本試驗所選的總生物堿樣品處理方法與含量測定方法的重復(fù)性良好。穩(wěn)定性試驗結(jié)果顯示，樣品待測溶液在放置不同時間時測定的吸光度間的RSD值為0.92%，表明本試驗方法制得的樣品待測溶液在室溫放置8 h內(nèi)穩(wěn)定。加樣回收率試驗結(jié)果顯示，5份混合樣品待測溶液的平均加樣回收率為99.22%，RSD值為1.34%，表明本試驗方法的加樣回收率良好。伸筋草總生物堿的含量測定結(jié)果顯示，所制得3份樣品待測液中總生物堿的平均含量為2.77 μg/mL，見表1。以平均含量計算得伸筋草提取物中所含總生物堿的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30.47 μg/mg。

表1 伸筋草總生物堿的含量測定結(jié)果

3.2 伸筋草總生物堿的急性毒性試驗結(jié)果

正常對照組小鼠均表現(xiàn)正常，未見死亡。試驗小鼠在灌胃給藥后多表現(xiàn)為食欲減弱，活動量減少，部分出現(xiàn)便溏現(xiàn)象，均在48 h內(nèi)恢復(fù)正常。1～3 d內(nèi)出現(xiàn)部分小鼠死亡，對死亡小鼠進行解剖，肉眼觀察心、肝、脾、胃、腎等主要臟器，未見明顯異常。3 d后未見繼續(xù)死亡情況，連續(xù)觀察14 d，存活情況良好，未出現(xiàn)其他毒性反應(yīng)。14 d后，處死所有試驗小鼠并解剖，肉眼觀察心、肝、脾、胃、腎等主要臟器，未見明顯異常。統(tǒng)計不同劑量給藥組小鼠的死亡率，Bliss 法計算伸筋草總生物堿提取物的LD50為11.62 g/kg，見表2。

表2 伸筋草總生物堿的急性毒性試驗結(jié)果

3.3 伸筋草總生物堿的抗炎活性研究結(jié)果

3.3.1 對弗氏完全佐劑致大鼠足跖腫脹的作用

實驗結(jié)果見表3。

表3 伸筋草總生物堿對弗氏完全佐劑致大鼠足跖腫脹的作用

由表3可以看出，與正常對照組相比，模型組大鼠的足跖腫脹改善率顯著升高(P<0.05)，可見弗氏完全佐劑誘導(dǎo)AA大鼠模型成功；與模型組相比，伸筋草高、中、低劑量組均能夠改善AA大鼠模型的足跖腫脹情況，且呈現(xiàn)劑量依賴性，其中伸筋草高、中劑量組改善效果顯著(P<0.05)。

3.3.2 對大鼠棉球肉芽腫增生的作用

實驗結(jié)果見表4。

由表4可以看出，與模型組相比，伸筋草高、中、低劑量組均能夠降低大鼠棉球肉芽腫的增生情況，且呈現(xiàn)劑量依賴性，其中伸筋草高、中劑量組降低效果顯著(P<0.05)。

表4 伸筋草總生物堿對大鼠棉球肉芽腫增生的作用

4 討論

伸筋草又名舒筋草，中醫(yī)常用于治療關(guān)節(jié)腫痛、風(fēng)寒濕痹、筋脈拘急等癥。研究報道，伸筋草具有較強的抗炎、抗風(fēng)濕作用[10-11]，其抗炎活性物質(zhì)可能為藥材中富含的生物堿成分[12-13]，基于此，本研究對伸筋草藥材中的生物堿成分進行了提取純化和抗炎活性研究，以進一步驗證伸筋草抗炎、抗風(fēng)濕的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，為臨床伸筋草藥物的應(yīng)用和抗炎抗風(fēng)濕藥物的開發(fā)提供新的理論依據(jù)。

伸筋草中富含的生物堿成分主要為石松堿、石松定堿、石松靈堿等[2]。傳統(tǒng)的生物堿提取方法多為堿性乙醇提取，三氯甲烷萃取，方法操作繁瑣，且不適用于工業(yè)化生產(chǎn)[6]，陽離子交換樹脂近年來常被用于生物堿的提取純化，具有吸附容量大、裝置簡單、易再生的優(yōu)點[14]，本研究采用強酸性陽離子交換樹脂對伸筋草中的生物堿成分進行提取，提取溶劑選擇極性較大的鹽酸水(濃度0.2%)，待藥物成分被陽離子交換樹脂充分吸附后， 以堿性氨水洗脫，使生物堿成分在堿性環(huán)境下充分游離，大大提高了伸筋草總生物堿的得率[15]。由于伸筋草中的生物堿成分多無市售，故研究選擇與伸筋草中生物堿結(jié)構(gòu)相近的苦參堿做為對照品，對伸筋草提取物中的總生物堿含量進行了測定，得到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30.47 μg/mg的伸筋草提取物總生物堿成分。

本研究對伸筋草總生物堿提取物進行了急性毒性試驗，結(jié)果顯示，部分試驗小鼠在給藥后短期內(nèi)表現(xiàn)為食欲減弱、活動量減少、便溏等輕微毒性反應(yīng)， 48 h內(nèi)即恢復(fù)正常。僅在1～3 d內(nèi)出現(xiàn)少量動物死亡，3 d后未見新的動物死亡，連續(xù)觀察14 d后，解剖可見心、肝、脾、胃、腎等主要臟器，未見明顯異常，Bliss法計算伸筋草總生物堿提取物的LD50為11.62 g/kg，遠超于正常人的服用劑量，可見，伸筋草總生物堿提取物的毒性較小，臨床應(yīng)用安全可靠。研究以弗氏完全佐劑致大鼠足跖腫脹試驗和大鼠棉球肉芽腫增生試驗，對伸筋草總生物堿的抗炎活性進行研究，結(jié)果顯示，伸筋草高、中、低劑量組均能夠改善佐劑型關(guān)節(jié)炎(AA)大鼠的足跖腫脹并降低大鼠棉球肉芽腫的增生情況，且呈現(xiàn)劑量依賴性，即給藥劑量越大，抗炎效果越佳。其中伸筋草高、中劑量組與模型組相比，改善效果顯著(P<0.05)。

綜上可見，采用強酸性陽離子交換樹脂提取純化伸筋草中的生物堿成分，效果較佳，得到的伸筋草總生物堿提取物未見明顯毒性，并具有較好的抗炎作用。