四種多糖體外抗氧化性及復合研究

張翔

【摘 要】為探討灰樹花、白樺茸、香菇、云芝真菌多糖的抗氧化性及復合抗氧化效果，采用水楊酸法及用L16（45） 正交實驗，以羥自由基清除率為評判依據，對多糖進行充分優化組合，測定并比較單味多糖和復合多糖對羥自由基的清除率。結果顯示：四種多糖對羥自由基的清除作用大小為：白樺茸>香菇>灰樹花>云芝;四種真菌粗多糖清除羥自由基組方的L16（45）正交實驗顯示，其復合多糖的最佳組方為：4. 46mg/mL灰樹花多糖、 4.22mg/mL白樺茸多糖、4.05mg/mL云芝多糖、 2.49mg/mL香菇糖組合。可見在相同濃度下復合多糖對羥自由基的清除率高于單味多糖清除率之和。灰樹花、白樺茸、香菇、云芝粗多糖及復合多糖在體外對羥自由基有較強的抑制作用，且相同濃度下復合多糖的抑制率大于單味多糖。此研究為灰樹花、白樺茸、香菇、云芝真菌粗多糖的應用及羥自由基清除劑的研究提供參考依據。

【關鍵詞】真菌多糖;抗氧化性;水楊酸法

【中圖分類號】R285.5 【文獻標識碼】A【文章編號】1002-8714（2020）09-0002-01

自由基是一類具有高度活性的物質，能引起細胞和細胞器膜的脂類過氧化損傷，進一步導致細胞膜功能喪失，是產生疾病的主要原因之一[1]。因此，廣泛地開發和尋找外源性的自由基清除劑具有重要意義。分子生物學的發展使人們逐漸認識到糖及其復合物分子具有極其重要的生物功能。多糖是生物體內除蛋白質和核酸外又一類重要的生物大分子，在控制細胞的分裂分化、調節細胞的生長、延緩衰老和維持代謝等方面發揮著重要的作用[2]。

近年來的研究顯示，一種真菌多糖通常對某一種生理效應有明顯作用或效果單一，對食藥用真菌多糖的研究逐漸向多種多糖復合生理效應的研究方向發展[3]。過往實驗證明，一些食藥用真菌多糖復合作用時，效果比單味多糖更佳，且它們之間的藥理作用呈現協同性[4]。為此本研究在前人工作的基礎上，擬以20%～40%含量的灰樹花、云芝、香菇、白樺茸真菌多糖為原料，進行抗氧化性及復合研究。

1 材料與方法

1.1儀器

UV1601紫外可見分光光度計、101-2BS 電熱鼓風干燥箱、AL104型電子分析天平、KQ-5200DE超聲波清洗器、CU420型電熱恒溫水箱、JB-90型清理電動攪拌機。

1.2試劑

乙醇、水楊酸、鹽酸、硫酸亞鐵、30%雙氧水、香菇粗多糖、云芝粗多糖、白樺茸粗多糖、灰樹花粗多糖及其他常規試劑。其中，多糖的含量分別為香菇33.20%、云芝40.45%、白樺茸42.16%、灰樹花30.36%。

1.3方法和步驟

1.3.1紫外分光光度法測定真菌多糖羥自由基清除率

1.3.1.1實驗原理

建立Fenton反應體系模型，利用H2O2與Fe2+混合產生·OH（H2O2+Fe2+→OH·+OH-+Fe3+），但由于·OH具有很高的反應活性，存活時間短，若在反應體系中加入水楊酸，就能有效地捕捉·OH，并產生有色產物。

該物質在510nm下有最大吸收，若在此反應體系中加入具有清除·OH功能的被測物，便會與水楊酸競爭·OH，從而使有色產物生成量減少。采用固定反應時間法，在相同體積的反應體系（0.2mmol/LH2O21mL，6mmol/LFe2+1mL，6mmol/L1mL水楊酸-乙醇溶液）中加入一系列1mL不同濃度的待測樣品。最后加H2O2啟動反應，37℃反應30min，以超純水：乙醇=3：1的混合溶液為參比，在510nm處測量各濃度下的吸光度。考慮待測溶液本底的吸光值不同，以6mmol/LFe2+1mL，6mmol/L水楊酸-乙醇溶液1mL，待測溶液1mL和雙蒸水1mL作為待測溶液的本底吸收值。其清除率計算公式為：

清除率（I%）=[A0-（Ax-Ax0）]/A0×100%

式中：A0：空白對照液的吸光度;

Ax：加人待測溶液后的吸光度;

Ax0：待測溶液的本底吸收。

1.3.1.2實驗步驟

1.3.1.2.1溶液的配制

①10mg/mL真菌粗多糖溶液：于分析天平上準確稱量粗多糖成品1.0000g，溶解并定容至100mL容量瓶，搖勻并于超聲波清洗機中超聲30min;

②7.5、5.0、2.5、1.0mg/mL真菌粗多糖溶液：用吸量管吸取配制好的10mg/mL的粗多糖溶液，用蒸餾水進行稀釋，并定容至50mL容量瓶中，搖勻;

36mmol/LFeSO4溶液：于分析天平準確稱取硫酸亞鐵固體粉末0.4170g，溶解、轉移并定容至250mL容量瓶中，搖勻后避光保存;

40.2mmol/LH2O2溶液：用吸量管吸取30%H2O2溶液0.2mL于250mL容量瓶中，蒸餾水定容至刻度并搖勻，避光保存;

56mmol/L水楊酸—乙醇溶液：于分析天平準確稱取水楊酸0.2097g，用乙醇全部溶解、轉移并定容至250mL容量瓶，搖勻。

1.3.1.2.2加樣方法

1.3.2四種多糖復合后清除羥自由基測定的原理和方法

本文用水楊酸分光光度法測定灰樹花、云芝、桑黃、白樺茸粗多糖對羥自由基的清除率，并以此為依據，對其進行復合研究.

1.3.3.1測定原理和方法同1.3.1.

1.3.3.2灰樹花、香菇、白樺茸、云芝復合多糖研究的正交實驗設計

采用L16（45）正交實驗測定灰樹花、香菇、白樺茸、云芝多糖對羥自由基的清除率，進行多糖組合用劑量的復合的組方實驗，四種粗多糖的正交實驗的因素水平設計如表2。

2 結果及結論

2.1灰樹花、香菇、白樺茸、云芝多糖對羥自由基清除率

按1.3.1方法測定灰樹花、香菇、白樺茸、云芝多糖和VC羥自由基的清除率如表3所示，可見該四種多糖具有較強的清除羥自由基的活性，是良好的羥自由基清除劑和抗氧化劑。究其抗氧化作用的機制，可能是通過提升SOD、CAT、T-AOC水平和降低MDA含量等有關[5]。

2.1.1灰樹花、香菇、白樺茸、云芝多糖的清除羥自由基作用的比較

按1.3.1方法測定灰樹花、香菇、白樺茸、云芝多糖對羥自由基的清除率，顯示四種多糖的清除羥自由基能力大小為：白樺茸>香菇>灰樹花>云芝，白樺茸、香菇、灰樹花、云芝多糖的最大清除率分別為：82.3%、74.5%、55.9%、52.7%。同樣條件下測定VC的最大清除率為99.8%。

2.1.2灰樹花、香菇、白樺茸、云芝多糖的清除羥自由基作用與VC比較

按1.3.1方法測定灰樹花、香菇、白樺茸、云芝多糖和VC對羥自由基的清除率，當清除率同為50%時，需要的濃度分別為VC0.359mg/mL，香菇5.074mg/mL，云芝9.500mg/mL，灰樹花8.829mg/mL，白樺茸3.965mg/mL。換算成質量，1gVC清除羥自由基的功效需要香菇14.1g或云芝26.5g或灰樹花24.6g或白樺茸11.0g。

2.2多糖復合研究

2.2.1四種多糖復合組方正交實驗結果

將四種復合多糖組方研究的因素水平設計進行L16（45）正交實驗方案，用1.3.1方法測定復合多糖對羥自由基的清除率，其正交實驗結果如表4所示.

2.2.2四種多糖復合組方正交實驗結果的極差分析

對四種多糖復合多糖的正交實驗結果進行極差分析，其結果如表5所示。

可得出如下結論：不同因素水平的影響強弱順序為：A4>A2>A1>A3，B4>B1>B3>B2，C1>C4>C2>C3，D4>D1>D2>D4;影響因素大小順序為B>C>A>D（R），從而初步認為最優配方組合為A4B4C1D4，即這四種復合多糖按其多糖含量計算其最佳組方為：4.46mg/mL灰樹花多糖、4.22mg/mL白樺茸多糖、4.05mg/mL云芝多糖、2.49mg/mL香菇多糖組合;折合30.36%灰樹花、42.16%白樺茸、40.45%云芝、33.20%香菇粗多糖的組方為：10mg/mL灰樹花、10mg/mL白樺茸、1mg/mL香菇、7.5mg/mL云芝粗多糖組合。

2.2.3復合多糖與四種單味多糖對羥自由基的清除率比較

在復合多糖的正交實驗中，當四種多糖的實測濃度為：1mg/mL、2.5mg/mL、5.0mg/mL、7.5mg/mL、10mg/mL時，其對羥自由基的抑制率分別為：19.1%、28.6%、47.9%、65.9%、72.8%，與同濃度的四種單一多糖對羥自由基的平均清除率的比較：在1mg/mL時，四種多糖清除率之和為13.5%，復合多糖則為19.1%;2.5mg/mL時，四種多糖清除率之和為23.3%，復合多糖則為28.6%;5.0mg/mL時，四種多糖清除率之和為41.2%，復合多糖為47.9%;7.5mg/mL時，四種多糖清除率之和為57.5%，復合多糖為65.9%;10mg/mL時，四種多糖清除率之和為66.4%，復合多糖為72.8%。由此可見，等量復合多糖比四種多糖對羥自由基清除率之和高，復合后的生物活性不是一種簡單的相加關系，這種作用可能是多糖經復合后產生的協同和互補作用所致。由此認為，選擇具有協同和互補作用的多糖進行優勢組合，可有效的發揮和提高各種多糖的生物學活性，并且可在一定范圍內減少用量，降低成本，提高功效。

參考文獻

[1] 以蒙醫學理論試論氧自由基與線粒體[J].伊拉古等.中國民族醫藥雜志.20120（26）.

[2] 黃芪多糖預防奶牛乳房炎的研究進展[J].沃野千里等.動物營養學報.2020（32）.

[3] 復合多糖抑制紫外線誘導皮膚細胞的光老化[J].楊凱業等.中國組織工程研究.2019（23）.

[4] 五種真菌的復合多糖體外抗氧化作用研究[J].于沖等.黑龍江科學.2018（9）.

[5] 中藥多糖抗氧化作用及其機制研究進展[J].孟祥云等.中華中醫藥雜志.2018（33）.