基于葉綠體matK基因序列的兩份安康野生桑遺傳特征分析

王瑞嫻 楚渠 彭云武

摘要：對陜西省安康市黃石灘、八仙鎮2份野生桑葉綠體基因組進行PCR擴增，獲得matK編碼基因及其側翼序列，擴增長度為1 715 bp，ORF長度為1 518 bp，2份序列僅存在1處單堿基差異。利用matK序列分析7份桑樹（Morus alba L.）之間的遺傳多樣性，結果表明，不同品種桑樹matK序列相似度較高，僅存在6個單位點堿基差異，定義3種單倍體，單倍型多樣度為0.714，核苷酸多樣度為0.001 32，平均核苷酸差異為2.000。遺傳距離分析表明，八仙鎮桑樹與印度桑（M. indica）、魯桑（M. multicaulis）的遺傳距離最近，黃石灘桑樹與蒙桑（M. mongolica）、華桑（M. cathayana）的遺傳距離最近。聚類分析將7份桑樹聚為1支，且桑樹品種之間的進化支長要明顯短于其他科屬之間的長度，表明桑樹品種間的遺傳多樣性較低，經歷較少進化事件。

關鍵詞：桑樹（Morus alba L.）;進化分析;遺傳多樣性;葉綠體;matK

中圖分類號：S888.2 ? ? ? ? 文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2020）15-0151-04

Abstract： The matK gene sequences of two wild mulberry that collected form Huangshitan and Baxian town （Ankang city， Shaanxi province） have been obtained by PCR. The length of amplified sequences is 1 715 bp while the ORF is 1 518 bp. Only one base difference when compared with each other. The genetic variations of 7 mulberry have been analyzed with the matK genes. The results showed that 6 variable sites were detected， which defined 3 haplotypes in Morus alba， and the haplotype diversity was 0.714. The nucleotide diversity was 0.001 32 and the average nucleotide difference was 2.000 respectively. As for the genetic distances， Baxian was closer to M. indica and M. multicaulis， while Huangshitan was closer to M. mongolica and M. cathayana. Cluster analysis demonstrated that the seven mulberries were grouped together， and the branch was shorter than other species， implied lower genetic diversity and fewer evolutionary events proceeded.

Key words： Morus alba L.; phylogenetic analysis; genetic diversity; chloroplast; matK

桑樹（Morus alba L.）是桑科桑屬（Morus）的一種多年生落葉喬木或灌木。桑樹可作為某些菌類培養的良好代料，亦可防風固沙，作為綠化和石漠化治理樹種，有很高的生態價值。桑葉是家蠶（Bombyx mori L.）惟一的飼料來源，可作為兔、羊、牛、豬等禽畜飼料添加物，同時也被開發成為諸多食品。中國衛生部批準的首批“藥食同源”食品中，桑葉名列其中[1-3]。中國是桑樹遺傳多樣性的起源中心之一，目前保存桑樹種質3 000余份，分屬15個種及4個變種，其中栽培種5個，野生種10個，是世界上桑種最多的國家[4]。對桑樹不同品種的親緣關系及遺傳多樣性進行研究，對桑樹種質資源收集、核心種質保存及新品種選育均具有重要意義。

葉綠體是大多數高等植物必不可少的細胞器，葉綠體基因組（cpDNA）編碼110～130個基因[5]，其中matK（maturase kinase）編碼一種RNA轉錄體中Ⅱ型內含子剪切的成熟酶，是葉綠體基因組中進化最快的編碼基因之一[6，7]。相對于cpDNA中其他基因序列，matK具有較多的A-T堿基對，3′端相對保守，5′端則變異較快，可進行植物科屬水平的系統發育研究，在植物屬及屬以下單位水平上為植物類群系統重建等工作提供較高的支持率[8，9]，在2009年被生命條形碼聯盟（CBOL）植物工作組人員列為DNA條形碼鑒定的核心序列之一[10]。滕艷芬等[11]通過分析屬間及5種藥典收載石斛種間的葉綠體matK基因序列，將不同屬及不同種間的正品與混淆品區分開，因此，matK基因序列可用于地道藥材的鑒別;劉靜等[12]分析了12種藥用石斛及密花石豆蘭的matK序列，比較其遺傳距離和堿基差異，認為matK基因可以在分子水平對石斛不同種及變種進行鑒別，可作為石斛屬植物的分子標記。

桑樹matK基因研究已有報道，趙衛國等[13]通過對2份桑品種的葉綠體trnL-trnF基因間隔區序列進行研究，得出兩者的同源性很高，且與菊科、薔薇科等都具有同源性;汪偉等[14]對關于桑樹 ?trnL內含子序列的分子系統學進行研究，得出桑樹為單系的結論;王暉等[15]對桑樹 matK基因進行了生物信息學分析;Kong等[16，17]利用葉綠體基因組對蒙桑（M. mongolica）、華桑（M. cathayana）和魯桑（M. multicaulis）等品種進行了遺傳進化分析。

本研究從2份安康市野生桑葉中提取全基因組，擴增測序獲得葉綠體matK序列，分析其序列特征，并分析桑樹遺傳聚類關系，從DNA水平上對桑樹種質資源的遺傳多樣性進行鑒定，為桑樹品種重要農藝性狀的基因發掘與利用提供理論依據和應用基礎。

1 材料與方法

1.1 桑樹

2份野生桑分別采集自陜西省安康市八仙鎮（8xian）和黃石灘（HST）。新鮮桑葉表面用乙醇消毒后置于硅膠上快速干燥，超低溫保存備用。

1.2 基因組DNA提取

采用SDS-CTAB法提取總DNA。稱取0.50 g干燥葉片，液氮研磨成粉末后，迅速加入DNA提取液（20 g/L CTAB，1.4 mol/L NaCl，0.1 mol/L Tris-HCl，20 mmol/L EDTA，pH 8.0），混勻，65 ℃孵育45 min;冷卻至室溫，加入苯酚/氯仿/異戊醇（25∶24∶1）的混合液500 μL，混勻;4 ℃，12 000 r/min離心10 min，將上清液轉移至1.5 mL滅菌離心管中，加2倍體積沉淀液，室溫下孵育60 min，4 ℃，12 000 r/min離心10 min;-20 ℃放置15 min，4 ℃，12 000 r/min離心10 min;用350 μL NaCl （1.2 mol/L）溶液溶解沉淀，待沉淀完全溶解后，加350 μL氯仿，混勻;4 ℃， ? 12 000 r/min離心10 min，上清液轉移至1.5 mL滅菌離心管，加0.6倍體積異戊醇，充分混勻;4 ℃， ? 13 000 r/min離心15 min，棄上清液;70%乙醇洗滌沉淀，12 000 r/min離心10 min，棄上清液，室溫干燥后，將DNA溶解在100 μL去離子水中;1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。DNA置于-20 ℃冰箱保存備用。

1.3 序列擴增和測序

根據GenBank中桑樹葉綠體基因組序列（登錄號NC_025772.2）設計引物。上游引物序列為5′-TGGTGCAGGAACAGGATGAAC-3′，下游引物序列為5′-GAGACCADTACTTGCTTTCAG-3′。引物序列由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

PCR擴增體系總體積50 μL，含20 ng/μL總DNA模板1.0 μL，10×PCR緩沖液5.0 μL，25 mmol/L MgCl2 5.0 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2.0 μL，2 μmol/L上、下游引物各0.5 μL，5 U/μL高保真聚合酶1.0 μL，ddH2O 35.0 μL。反應條件為94 ℃預變性4 min，94 ℃變性 40 s，52 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，共32個循環，最后72 ℃延伸10 min。

PCR產物用1.2%（W/V）瓊脂糖凝膠電泳鑒定，切取目的條帶，利用OMEGA膠回收試劑盒（OMEGA Gel Extraction Kit，美國）回收和純化核酸片段，操作步驟按照試劑盒說明書進行。回收獲得的PCR產物經過1.2%（W/V）瓊脂糖凝膠電泳檢測，合格目的條帶應表現單一、清晰。檢測合格之后的PCR回收產物送生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。

1.4 數據分析

從GenBank中獲得蒙桑、川桑（M. notabilis）、魯桑等桑樹葉綠體matK基因序列。利用MUSLE軟件包進行核苷酸、氨基酸序列的同源性比對和相似性分析;采用DNAsp統計單倍型，計算單核苷酸位點多態性、平均核苷酸差異、單倍型多樣度、核苷酸多樣度等群體遺傳學參數;采用MEGA6.0軟件以鄰接法（neighbor-joining）構建系統發生樹，參數為Bootstrap=1 000，Poisson model，gaps/missing處理方式為pairwise deletion。

2 結果與分析

2.1 桑葉形態和序列擴增

八仙鎮同株桑葉有全葉和裂葉之分，葉尖呈長尾狀，葉基為深心形，葉緣銳鋸齒，葉面粗糙有毛。黃石灘桑葉多裂，葉尖呈尾狀，葉基為深心形，葉緣銳鋸齒，葉面平滑有光澤（圖1）。利用所設計的引物，以桑葉基因組為模板進行擴增。經過克隆和測序分析，擴增序列長1 715 bp，其中包含長度為1 518 bp的ORF框，ORF的起始密碼子為ATG，終止密碼子為TGA（圖2），ORF框編碼蛋白的結構域分析表明其中含有1個名為matK的保守結構域，表明擴增序列為桑樹葉綠體matK基因的開放閱讀框及其側翼序列。

2.2 序列比對

編碼序列比對表明，黃石灘和八仙鎮桑樹matK擴增序列僅在ORF框內660 bp處存在1個單核苷酸位點差異，其中黃石灘桑樹為胞嘧啶堿基，八仙鎮桑樹為胸腺嘧啶堿基。將擴增獲得的matK基因編碼序列與其他5份桑樹的同源序列進行聯配比對和遺傳多樣性分析（圖2），結果表明，matK基因在不同桑樹之間表現出高度一致性，僅在558、660、716、795、1 188、1 294等6個單堿基位點上出現差異，未出現插入或缺失等變異，核苷酸多樣度π為0.001 32，平均核苷酸差異k為2.000，7份桑樹matK基因共定義3種單倍型，單倍型多樣度為0.714，其中川桑定義1種單倍型，蒙桑、華桑和黃石灘桑樹種共享1種單倍型，印度桑（M. indica）、魯桑和八仙鎮桑樹種共享另一種單倍型。

2.3 遺傳距離和進化分析

從數據庫中下載不同種屬的代表性matK序列，與桑樹matK序列一起計算遺傳距離，構建進化樹。結果表明，不同桑樹品種間的遺傳距離為0.000 00～0.003 96。八仙鎮桑樹與印度桑、魯桑的遺傳距離最近，與川桑遺傳距離較遠，黃石灘桑樹與蒙桑、華桑的遺傳距離最近，與川桑遺傳距離較遠（表1）。進化樹聚類表明，不同科屬植物分別聚類，其中本研究中2份桑樹與其他5份桑樹聚為一支，同時桑樹品種間的進化支長要明顯短于其他科屬間的長度，表明桑樹品種間的遺傳多樣性較低，經歷較少進化事件（圖3）。

3 小結

本研究在2份安康野生桑樹葉綠體中擴增得到matK編碼基因及其兩側部分序列，2份桑樹matK序列僅存在1處堿基差異，并利用該序列分析桑樹間的遺傳多樣性。結果表明，不同品種桑樹的matK序列僅在6個位點上存在單堿基差異，品種間的序列相似性水平較高，進化和遺傳距離分析表明2份桑樹獲得的序列與其他5份桑樹聚為一支，分別與印度桑、華桑等親緣關系最為接近，表明本研究中采用的桑樹可能是眾多桑樹資源中新的桑樹品種。進化分析還表明，桑樹品種間較其他科屬植物經歷了較少的進化時間。考慮到不同桑樹品種間matK序列的高度相似性，matK序列并不能很好地區分桑樹品種之間的進化關系，因此在后續研究中采用葉綠體全基因組的分析，可能更有利于分析桑樹的遺傳多樣性、分類及進化關系。

參考文獻：

[1] 黃自然，楊 軍，呂雪娟. 桑樹作為動物飼料的應用價值與研究進展[J]. 蠶業科學，2006（3）：377-385.

[2] 范 浩，莊 愉. 桑葉藥食同源開發應用研究進展[J]. 現代農業科技，2017（14）：78-79， 83.

[3] 曾衛湘. 53份桑資源葉的藥用品質評價[D]. 重慶：西南大學，2017.

[4] 中國農業科學院蠶業研究所. 中國桑樹栽培學[M]. 上海：上海科學技術出版社， 1985.

[5] 張同武. 植物細胞器基因組測序，組裝及比較基因組學研究[D]. 杭州：浙江大學，2012.

[6] HILU K W， LIANG H P. The matK gene： Sequence variation and application in plant systematics[J]. American journal of botany，1997，84（6）：830-839.

[7] OZDILEK A， CENGEL B， KANDEMIR G， et al. Molecular phylogeny of relict-endemic liquidambar orientalis mill based on sequence diversity of the chloroplast-encoded matK gene [J]. Plant systematics and evolution，2012，298（2）： 337-349.

[8] PLUNKETT G M，SOLTIS D E，SOLTIS P. Clarification of the relationship beteen apiaceae and araliaceae based on matK and rbcL sequence data[J]. ?American journal of botany，1997，84（4）：565.

[9] SPECHT C D， KRESS W J， STEVENSON D W， et al. A molecular phylogeny of costaceae （Zingiberales）[J]. ?Molecular phylogenetics and evolution，2001，21（3）：333-345.

[10] 劉宇婧，劉 越，黃耀江，等. 植物DNA條形碼技術的發展及應用[J]. 植物資源與環境學報，2011，20（1）：74-82， 93.

[11] 滕艷芬，吳曉俊，徐 紅，等. 石斛及其常見混淆品的matK基因序列比較[J]. 中國藥科大學學報，2002（4）：18-21.

[12] 劉 靜，何 濤，淳 澤. 藥用石斛的葉綠體matK基因序列分析及鑒別[J]. 藥學學報，2009，44（9）：1051-1055.

[13] 趙衛國，張志芳，潘一樂，等. 桑樹trnL-trnF基因間隔區序列的特點及分析[J]. 蠶業科學，2002，28（2）：83-86.

[14] 汪 偉，王興科，朱昱萍，等. 基于trnL內含子序列的桑屬植物分子系統學初探[J]. 蠶業科學，2008，34（2）：298-301.

[15] 王 暉，高妍夏，高德滿，等. 桑樹matK基因的生物信息學分析[J]. 北方蠶業，2014，35（4）：14-17.

[16] KONG W Q， YANG J H. The complete chloroplast genome sequence of Morus mongolica and a comparative analysis within the fabidae clade[J]. Curr genet， 2016， 62（1）：165-72.

[17] KONG W Q， YANG J H. The complete chloroplast genome sequence of Morus cathayana and Morus multicaulis， and comparative analysis within genus Morus L[J]. Peerj， 2017， 5：e3037.