GLP-1對AD神經元PI3K-AKT-GSK3β通路調節作用研究

李晶鑫 魏亞芬 殷萍

【摘 要】目的：探討胰高血糖素樣多肽-1（Glucagon like polypeptide -1，GLP-1）對阿爾茨海默病（Alzheimers disease，AD）神經元磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）- 蛋白激酶B（AKT）- 糖原合成酶激酶 3（GSK3β）通路調節作用。方法：以Aβ25-35孵育神經元細胞系PC12細胞制備的AD細胞模型為研究對象，分為3組：空白對照組、Aβ組和Aβ+GLP-1組.使用MTT法檢測各組細胞存活率，Western blot 方法檢測各組細胞PI3K-AKT-GSK3β表達水平。結果：與空白對照組相比，Aβ組細胞存活率明顯降低（P<0.05）;與Aβ組相比，Aβ+GLP-1組細胞存活率明顯升高（P<0.05）。Aβ組PI3K、AKT表達水平明顯低于空白對照組，GSK3β表達水平高于空白對照組（P<0.05）;Aβ+GLP-1組PI3K、AKT表達水平明顯高于Aβ組，GSK3β表達水平低于Aβ組（P<0.05）。結論：GLP-1通過調節PI3K-AKT-GSK3β的表達水平改善AD細胞模型存活率。

【關鍵詞】胰高血糖素樣多肽-1;阿爾茨海默病;神經元

【中圖分類號】R749.16【文獻標識碼】B【文章編號】1002-8714（2020）09-0124-01

AD是目前生活中常見的中樞神經系統慢性進展性的退行性疾病，臨床上常見表現為進行性的記憶功能減退和認知功能障礙[1]。胰高血糖素樣多肽一1（Glucagon-1ike peptide-1，GLP-1）可通過與GLP-1受體的介導實現對神經元的保護作用[2]。GLP-1是由腸粘膜內分泌細胞以及腦神經細胞中產生的一種多肽類激素，可以通過一種特異的肽轉運體經血液循環進入大腦[3]。本文旨在分析GLP-1對AD神經元PI3K-AKT-GSK3β通路調節作用，現將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1一般資料

以Aβ25-35孵育神經元細胞系PC12細胞制備的AD細胞模型為研究對象，分為3組：空白對照組、Aβ組和Aβ+GLP-1組.

1.2方法

實驗分組：空白對照組、Aβ 組、Aβ+GLP-1組。Aβ的濃度均為 20 μmol/，Aβ+GLP-1組：先加Aβ孵育 1 h 后再加GLP-1，GLP-1濃度為20 μmol/L。使用MTT法檢測各組細胞的存活率，Western-Blot法檢測各組PI3K-AKT-GSK3β的表達。

1.3觀察指標

MTT比色法檢測細胞存活率：取各組細胞，去除細胞消化液，加入細胞培養液5ml，吹打成懸液后，離心1500r/m2min，棄上清，再使用同種培養液吹打調節細胞濃度至1×105/ml，接種在96孔板100μL/孔，放置在CO2培養箱內24h。然后每孔加入20μlMTT繼續培養4h，之后取上清，每孔加入150μlDMSO，劇烈搖晃10min，溶解結晶。上酶標儀取波長為，比色記錄結果。細胞存活率=（實驗組OD值-空白對照組OD值）/（對照組OD值-空白對照組OD值）

Western-Blot檢測：在實驗設計終止的時間點收集樣本，裂解細胞，提取蛋白，測定蛋白濃度。利用聚丙烯酰胺-凝膠電泳根據蛋白的分子量分離蛋白：將蛋白轉到PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉，一抗4℃孵育過夜;第二天充分洗滌后二抗室溫孵育1h;最后加ECL反應液后曝光。確定特異性蛋白條帶后用Image J軟件定量檢測條帶的灰度值。

1.4統計學分析

用spss19.0軟件包進行數據處理，計量資料以均數±標準差表示（-x±s），組間比較采用F檢驗，P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1各組細胞存活率的對比：與空白對照組相比，Aβ組細胞存活率明顯降低（P<0.05）;Aβ+GLP-1組細胞存活率明顯高于空白對照組和Aβ組（P<0.05）。（詳見表1）

3 討論

PI3K-AKT-GSK3β通路由PI3K、AKT及GSK3β三部分組成，是神經系統里重要的信號通路，參與神經元極性、神經系統穩態維持和神經元凋亡等，具有多種關鍵的調控作用。PI3K是一種胞內磷脂酰肌醇激酶，可調節細胞增殖、分化、凋亡和葡萄糖轉運等多種細胞功能。AKT作為PI3K的下游蛋白分子，在代謝葡萄糖和細胞增殖、轉錄及凋亡中起到重要作用。GSK3β是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，普遍存在于體內真核細胞中，與眾多蛋白結構蛋白和轉錄因子相作用，調節細胞的分化、增殖、存活和凋亡。在相關研究中發現，AD患者神經元PI3K-AKT表達水平明顯降低，GSK3β升高。

GLP-1是一種氨基酸組成的內源性胰島素樣腸肽，可調節血糖，相關研究顯示，GLP-1可起到保護神經和抑制老年斑生成的作用，這提示GLP-1在防治AD方面有積極作用。本研究應用GLP-1對AD細胞和動物模型進行干預，觀察GLP-1的神經保護作用及對PI3K-AKT-GSK3β信號轉導通路的影響。有相關文獻顯示，GLP-1及其衍生物已被證實具有神經保護作用，且能改善AD模型的記憶和認知功能。但GLP-1是否通過PI3K-AKT-GSK3β通路發揮神經保護作用有待研究。

從本文研究結果發現：① GLP-1可以改善AD細胞模型存活率。②與正常對照組相比，Aβ可使PI3K、AKT表達降低，GSK3β表達升高。③GLP-1可以逆轉Aβ引起的PI3K、AKT表達降低、GSK3β表達升高。以上結果提示GLP-1通過調節PI3K-AKT-GSK3β的表達水平改善AD細胞模型存活率。

參考文獻

[1] 曾高峰， 宗少暉， 傅松文，等. PI3K/Akt/GSK-3β信號通路在6-姜酚保護PC12細胞對抗β淀粉樣蛋白誘導細胞凋亡的作用[J]. 天然產物研究與開發， 2015， v.27（11）：25-28.

[2] 吳愛兵， 黎明春， 麥宗炯，等. CK2α通過PI3K/Akt/GSK-3β信號通路調控肺腺癌A549細胞的侵襲及遷移[J]. 中國肺癌雜志， 2017， 020（004）：233-238.