重金屬對鯽魚的毒性及其相關(guān)生物標(biāo)志物的研究

劉小真，鐘瑾慧，熊 戩

(南昌大學(xué)資源環(huán)境與化工學(xué)院；鄱陽湖環(huán)境與資源利用教育部重點(diǎn)實驗室，江西 南昌 330031)

工業(yè)化進(jìn)程的加快以及人類生產(chǎn)活動的不規(guī)范化等多因素使得環(huán)境中存在大量的重金屬污染物，由此導(dǎo)致的生態(tài)危害和健康損害事件時有發(fā)生[1]。重金屬是一類有潛在危害的重要污染物，它極難降解、易被生物富集并有生物放大效應(yīng)等特點(diǎn)，有較大的生態(tài)危害性[2]。

環(huán)境中廣泛存在鉛、鎘污染，過量攝入鉛、鎘對水生生物產(chǎn)生系列毒性效應(yīng)，引起魚體生物反應(yīng)異常(游動能力下降、身體側(cè)翻)，破壞魚體器官組織結(jié)構(gòu)、引起組織病變，包括改變酶活性、損傷細(xì)胞器、致死等[3]；因此研究重金屬的生態(tài)毒性尤為重要。鉛、鎘在低濃度下可引起機(jī)體的氧化應(yīng)激和氧化損傷[4-5]，通過檢測魚體內(nèi)相關(guān)指標(biāo)可以判斷其受重金屬的影響程度。胡蓉[6]、卓麗玲[7]等研究鯽魚對Pb2+、Cd2+24 h的最大耐受質(zhì)量濃度分別為15、0.54 mg·L-1，鉛、鎘引起的氧化應(yīng)激可以通過抗氧化酶的活性變化來反應(yīng)[8-9]。抗氧化酶是生物體受到氧化脅迫和損傷情況下的主要生物標(biāo)志物，生物受到污染脅迫時會刺激體內(nèi)產(chǎn)生活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)，進(jìn)而誘導(dǎo)抗氧化酶系統(tǒng)的響應(yīng)，其響應(yīng)是為了一定程度上消除活性氧自由基，維系膜系統(tǒng)的穩(wěn)定性，降低細(xì)胞受傷害的程度[10-11]。關(guān)于重金屬誘導(dǎo)魚類氧化應(yīng)激的研究大多集中在毒性機(jī)制上[12]，早期預(yù)警生物標(biāo)志物的研究有待加強(qiáng)。

1 材料與方法

1.1 蚌湖地理位置介紹

鄱陽湖位于江西省北部，地理坐標(biāo)28°22′-29°45′N,115°47′-116°45′E，是一個過水性、吞吐型的淺水湖泊[14]。蚌湖位于鄱陽湖西北，屬于鄱陽湖邊緣的一個天然湖泊(29.268°-29.271°N，115.934°-115.979°E)，面積約80 km2；蚌湖及其周邊水域存在明顯的水位波動性，豐水期鄱陽湖水體越過貫通口進(jìn)入蚌湖，此時蚌湖與鄱陽湖連成一整體水域，枯水期蚌湖水位降低，形成與多個外界隔離的湖泊[15]。(見圖1)

蚌湖水體pH值為7.56±0.44，水質(zhì)硬度在100～130 mg·L-1，水中氧濃度保持在飽和濃度的70%～115%。參照相關(guān)文獻(xiàn)[15]及《土壤環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》(GB 15618—1995,2008)，蚌湖表層沉積物中Pb、Cd濃度分別達(dá)到二級、三級標(biāo)準(zhǔn)(見表1)。

表1 鉛、鎘土壤環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)值/(mg·kg-1)

1.2 實驗對象的獲取及飼養(yǎng)

蚌湖內(nèi)有豐富的鯽魚和鯉魚，鯽魚是水生生態(tài)系統(tǒng)食物鏈中極為重要的一環(huán)，它能夠?qū)λh(huán)境中物理、化學(xué)和生物因素的變化做出敏銳的反應(yīng)，所以在評價環(huán)境污染及生態(tài)風(fēng)險中表現(xiàn)出突出的實用價值[16-17]。其主要優(yōu)點(diǎn)有：分布廣泛，容易獲得；個體適中，適于實驗室飼養(yǎng)；是蚌湖流域水生生物優(yōu)勢物種，有代表性。因此染毒實驗以鯽魚為研究對象，本研究所用鯽魚均捕獲自蚌湖，選擇鮮活、無損傷，且體型大小相似，體長(8.0±0.5)cm，體重(12.0±0.5)g。鯽魚在實驗室馴養(yǎng)至少7 d(期間死亡率低于10%)，實驗水質(zhì)條件真實模擬蚌湖水環(huán)境狀況，水溫維持(20±2)℃，pH控制范圍為6.5～8，溶解氧量為7 mg·L-1以上，水體硬度控制在100～130 mg·L-1(CaCO3)，馴養(yǎng)期間每天喂食1次(喂食0.5 h后清除殘餌及糞便)，實驗前24 h停止喂食。

1.3 主要試劑及儀器

儀器：可見分光光度計(722G，上海分析儀器有限公司)、漩渦混合器(XW-80A，上海精科實業(yè)有限公司)、電熱恒溫培養(yǎng)箱(DRP-9163型，上海森信實驗儀器有限公司)、高速臺式離心機(jī)(GT16-3A，北京時代北利離心機(jī)有限公司)等相關(guān)基礎(chǔ)實驗儀器。

試劑：乙二胺四乙酸二鈉(Na2EDTA)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、考馬斯亮藍(lán)(G250)、牛血清白蛋白(BSA)等，MDA、T-SOD、MTs和ECOD測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.4 實驗設(shè)計

重金屬染毒實驗：選用對重金屬敏感的4種抗氧化酶研究鯽魚由Pb、Cd引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)。為避免水環(huán)境綜合因素的影響，依據(jù)蚌湖表層沉積物重金屬污染情況及前期淡水環(huán)境中檢測的Pb、Cd含量(0.01，0.001 mg·L-1)，以《地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》為依據(jù)設(shè)置Pb2+，Cd2+兩種重金屬的染毒實驗濃度，設(shè)置4個濃度梯度，最高濃度設(shè)置為Ⅴ類水質(zhì)限值的5倍。具體濃度設(shè)置如表2所示。

表2 染毒試驗重金屬濃度/(mg·L-1)

鯽魚染毒實驗選取規(guī)格大小一致、反應(yīng)靈敏個體隨機(jī)分為9個處理組，包括一組空白對照和兩種重金屬分別設(shè)置的四個暴露濃度組，每個處理組3個重復(fù)，每個重復(fù)10尾魚。實驗用水均為曝氣3 d以上的自來水(去除水中的溶解氯)；實驗期間pH值、水質(zhì)硬度、溶解氧均符合蚌湖水質(zhì)參數(shù)，水溫維持在(20±2)℃，實際鯽魚的生物量控制在≤0.5 g·L-1。采用動態(tài)染毒法，各魚缸中溶液體積均為15 L，每天更新30%的試驗液，持續(xù)曝氣，實驗期間不投餌料，染毒時間為8 d。隨機(jī)選取魚體作為供試材料，迅速解剖魚體，用吸水紙吸干組織表面水，摘取肌肉、腦、肝臟、鰓四種組織放入-20 ℃冰箱中貯存。MDA、T-SOD、MTs和ECOD等酶活性，均采用南京建成生物工程研究所的商品試劑盒測試，其對應(yīng)測試步驟嚴(yán)格按照試劑盒的使用說明執(zhí)行。

經(jīng)濟(jì)全球化和“一帶一路”戰(zhàn)略為中國教育國際化提供了千載難逢的機(jī)遇。為了與“一帶一路”國家人民的發(fā)展和人才需求相對接，近年來，很多高職院校紛紛開展了國際合作辦學(xué)項目，既“走出去”，也“請進(jìn)來”，為高職院校綜合實力的提升和人才規(guī)格提高提供了良好的途徑。但是，由于高職院校合作辦學(xué)起步較晚，辦學(xué)過程中面臨的問題較多，影響了國際合作辦學(xué)的深入開展。本文從高職院校合作辦學(xué)過程中學(xué)生跨文化交際能力培養(yǎng)所面臨的問題著手，探索提高學(xué)生跨文化交際能力的方法，以促進(jìn)高職院校國際合作辦學(xué)更好地向前發(fā)展。

1.5 組織勻漿制備

(1)稱取鯽魚組織(0.2～1.0)g在2～5 mg在冰生理鹽水中漂洗，除去血液并用濾紙吸干，放入10 mL小燒杯內(nèi)；(2)將鯽魚組織在0.86%冷生理鹽水中剪碎并倒入玻璃勻漿管中，將搗桿垂直插入套管中，上下研磨數(shù)十次，充分研碎使組織勻漿化；(3)將制備好的勻漿用冷凍離心機(jī)(轉(zhuǎn)速2 000 r·min-1)離心10～15 min，收集離心后的上清液為勻漿液。

2 結(jié)果與分析

2.1 鯽魚Pb2+、Cd2+染毒實驗中MDA變化情況

對鯽魚進(jìn)行Pb2+、Cd2+染毒試驗，MDA測定結(jié)果如圖2所示。

暴露于Pb2+溶液8 d后，肌肉MDA除0.1 mg·L-1濃度處顯著高于對照組(P<0.05)，其余濃度暴露下肌肉MDA含量與對照組無明顯差異；腦組織中MDA隨濃度呈波動變化，且與對照組無顯著差異；肝臟中各濃度組MDA顯著高于對照組(P<0.05)，且與暴露濃度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。

隨著Cd2+濃度的逐步增加，肝臟各暴露組MDA隨Cd2+濃度升高含量增加，呈正相關(guān)且與對照組有顯著差異(P<0.05)；肌肉和腮中MDA呈相似的波動變化，都在0.01 mg·L-1濃度處出現(xiàn)下降現(xiàn)象；腦MDA隨濃度升高先增加，隨后在0.5 mg·L-1濃度處出現(xiàn)下降。

Pb2+、Cd2+暴露后對鯽魚各組織MDA的影響如圖2所示，由圖中可以看出Pb2+暴露下除腦組織外各組織MDA隨濃度均有先增加后下降的趨勢。魚體細(xì)胞受到氧化脅迫產(chǎn)生ROS，ROS容易攻擊生物膜上的磷脂、膜受體等不飽和脂肪酸類大分子物質(zhì)，從而引起脂質(zhì)發(fā)生過氧化[18]。MDA是脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物，它反映了機(jī)體受氧化損傷的程度。各Pb2+暴露組實驗開始后，鯽魚肝臟和腮MDA含量顯著升高，表明Pb2+脅迫下，機(jī)體ROS含量增多造成脂質(zhì)過氧化程度增強(qiáng)。而后暴露濃度升高，魚體無法適應(yīng)高濃度暴露環(huán)境，MDA含量下降，機(jī)體受到損傷逐漸傾向于氧化狀態(tài)。Cd2+暴露下腦組織中出現(xiàn)同樣現(xiàn)象，而肝臟MDA在Cd2+暴露下表現(xiàn)出明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系。卓麗玲[7]、金葉飛[19]等相關(guān)研究表明，染Cd2+組隨暴露濃度的增加，鯽魚肌肉、肝臟、腮的Cd蓄積量均出現(xiàn)顯著增加(P<0.05)，各組織蓄積量順序為：肝臟>鰓>肌肉；肝臟組織富集系數(shù)及敏感程度大于其他組織，主要原因為肝臟是魚體蓄積重金屬及解毒的主要器官，是鎘代謝的中心區(qū)域。所以呈現(xiàn)出鯽魚肝臟MDA含量明顯高于其他組織。圖中看出肝臟組織在此濃度范圍內(nèi)對Cd2+濃度變化敏感，能夠成為Cd污染的良好指示劑。這與王學(xué)鋒[20]等對Cd2+暴露下鯽魚肝臟MDA活性變化的相一致。

2.2 鯽魚Pb2+、Cd2+染毒實驗中T-SOD變化情況

對鯽魚進(jìn)行Pb2+、Cd2+染毒試驗，T-SOD活性測定結(jié)果如圖3所示。

暴露于Pb2+溶液8 d后，肌肉T-SOD活性隨暴露濃度先升高，而后在0.5 mg·L-1濃度處活性降低，與肌肉MDA變化趨勢一致；腦和腮組織中T-SOD呈現(xiàn)波動變化；肝臟T-SOD在0.01 mg·L-1處受到顯著誘導(dǎo)(P<0.05)，隨后活性隨濃度逐漸降低，呈負(fù)相關(guān)。

暴露于Cd2+溶液8 d后，四種組織T-SOD呈波動變化，活性均在高暴露組出現(xiàn)下降趨勢；肌肉與肝臟T-SOD在0.05 mg·L-1Cd2+暴露下活性下降，腦組織T-SOD在0.001 mg·L-1Cd2+暴露下受到顯著誘導(dǎo)(P<0.05)，隨后波動變化至對照組水平。

2.3 鯽魚Pb2+、Cd2+染毒實驗中MTs變化情況

對鯽魚進(jìn)行Pb2+、Cd2+染毒試驗，MTs活性測定結(jié)果如圖4所示。

暴露于Pb2+溶液8 d后，MTs在四種組織中酶活性均出現(xiàn)顯著上升趨勢(P<0.05)，腦、肝臟兩組織活性變化相似，均與暴露濃度呈正相關(guān)關(guān)系，在0.5 mg·L-1Pb2+濃度處呈現(xiàn)最大誘導(dǎo)；肌肉MTs出現(xiàn)先升高后在0.5 mg·L-1Pb2+濃度處活性降低；腮中活性呈現(xiàn)波動變化。

暴露于Cd2+溶液8 d后，肌肉、腦、肝臟中MTs活性變化趨勢一致，MTs在前3個暴露漸升高，在0.01 mg·L-1Cd2+處達(dá)到最大值且與對照組有顯著差異(P<0.05)，而后0.05 mg·L-1Cd2+濃度處活性回復(fù)至對照組水平；而鰓組織MTs隨暴露濃度增加活性升高，劑量效應(yīng)關(guān)系明顯。

MTs是唯一一種在重金屬代謝中起明確作用的非酶低分子蛋白質(zhì)，具有抵御氧化損傷的作用[24-25]。MTs活性變化過程與前兩種酶相似，隨暴露濃度升高M(jìn)Ts活性上升以應(yīng)對機(jī)體毒性損傷。MTs對于重金屬脅迫具有特異性，能夠與有毒金屬如Cd、Hg相結(jié)合并清除活性氧自由基，MTs作為重金屬尤其是Cd暴露的生物標(biāo)志物已廣泛應(yīng)用于實踐中[26]。從圖中可以看出腦、肝臟MTs與Pb暴露濃度呈正相關(guān)關(guān)系，可以作為Pb污染的理想生物標(biāo)志物；腮組織與Cd暴露濃度呈正相關(guān)，可以作為該濃度范圍內(nèi)Cd暴露的良好指示劑。這與Hamza-Chaffai[27]對蛤的原位重金屬暴露研究結(jié)論一致。

2.4 鯽魚Pb2+、Cd2+染毒實驗中ECOD變化情況

對鯽魚進(jìn)行Pb2+、Cd2+染毒試驗，ECOD活性測定結(jié)果如圖5所示。

暴露于Pb2+溶液8 d后，4種組織中ECOD活性均出現(xiàn)先升后降的變化；腦和腮暴露組活性呈現(xiàn)波動變化；肌肉和肝臟活性變化均表現(xiàn)為先升后降。隨著Cd2+濃度的逐步增加，腦與鰓組織間ECOD活性變化一致；肌肉與肝臟中變化趨勢類似，均在0.005 mg·L-1濃度下活性最大，尤其肝臟ECOD在0.005 mg·L-1Cd2+暴露下受到顯著誘導(dǎo)(P<0.05)，明顯高于其他暴露組。

ECOD在各組織中未表現(xiàn)出明顯規(guī)律。肝臟ECOD在0.005 mg·L-1Cd2+濃度下急劇增加至最大值，ECOD能夠催化細(xì)胞色素P450酶系CYP的活性，CYP是生物體內(nèi)重要的代謝解毒酶，說明該濃度處酶活性顯著誘導(dǎo)以催化CYP的活性達(dá)到機(jī)體解毒的目的；而后濃度升高酶活性下降表明機(jī)體在該暴露濃度下逐漸氧化損傷。

3 結(jié)論

重金屬Pb、Cd對水體鯽魚染毒實驗研究表明：

在0.5 mg·L-1Pb2+濃度范圍內(nèi)鯽魚腦和肝臟組織MTs活性與Pb2+暴露濃度高度正相關(guān)，腦組織和肝臟組織MTs可以作為評價該濃度范圍內(nèi)Pb污染的理想生物標(biāo)志物。在0.05 mg·L-1Cd2+濃度范圍內(nèi)，肝臟MDA、鰓組織MTs與Cd2+暴露濃度相關(guān)性高，呈現(xiàn)顯著的劑量效應(yīng)變化(P<0.05)，是水環(huán)境中該濃度范圍內(nèi)Cd污染預(yù)警的有效生物標(biāo)志物。

通過染毒實驗結(jié)果對比，可以看出鯽魚體內(nèi)的毒性代謝機(jī)理非常復(fù)雜，不同重金屬的暴露實驗，抗氧化防御系統(tǒng)中各酶活性的變化，側(cè)面反映蚌湖水質(zhì)條件下重金屬Pb、Cd對鯽魚肌肉、腦、肝臟、腮組織的氧化損傷。