丹酚酸A對高脂飲食引起的NAFLD小鼠腸道菌群異常的研究

賴尚磊 馮璐燕 丁秦超 陳歡 李松濤 竇曉兵*

非酒精性脂肪性肝病（Non-alcoholic Fatty Liver Disease，NAFLD）是指除外酒精和其他明確的損肝因素所致的，肝細(xì)胞內(nèi)脂肪過度沉積為主要特征的臨床病理綜合征，近年來，NAFLD的發(fā)病率逐年升高，據(jù)估計(jì)全球一般人群的患病率約為20%～30%，在肥胖或糖尿病人群中高達(dá)70%～90%［1-2］。腸道微生物目前被公認(rèn)為NAFLD發(fā)病的關(guān)鍵因素，肝臟和腸道有密切的解剖和功能關(guān)系，腸道菌群的相關(guān)代謝產(chǎn)物可以通過肝門靜脈進(jìn)入肝臟，從而影響肝臟代謝，并且目前已發(fā)現(xiàn)在NAFLD老鼠模型和患者中，其腸道菌群的結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著的變化［3-4］，因此腸道菌群已成為治療NAFLD疾病的新靶點(diǎn)。近年研究表明，中藥在治療疾病的同時(shí)調(diào)整了腸道菌群的結(jié)構(gòu)［5］，這可能是中藥發(fā)揮治療作用的機(jī)制之一。中藥丹參作為“活血化瘀”藥一直被中醫(yī)作為治療NAFLD的首選，丹酚酸A（Salvianolicacid A，SAA）是丹參主要成分之一，已有研究發(fā)現(xiàn)SAA可減輕高脂飲食（High fat diet，HFD）誘導(dǎo)的NAFLD［6］，而其改善NAFLD的機(jī)制尚未完全明確。本研究旨在探討SAA對HFD誘導(dǎo)的小鼠肝臟脂質(zhì)沉積及損傷的作用機(jī)制及其對腸道菌群的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 18只清潔級(jí)C57BL/6 雄性小鼠，8周齡，體重（25.0±0.5）g，由上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（浙）2008-0037。

1.2 試劑和儀器 （1）試劑：SAA 購于成都曼思特生物科技有限公司（批號(hào)：MUST-17022805），高脂飼料購于美國New Brunswick 公司（批號(hào)：D12492），果糖購于美國Acros Organics 公司（批號(hào)：C16135），蔗糖購于美國 Sigma-Aldrich 公司（批號(hào)：S7903），生理鹽水購于上海振譽(yù)生物科技有限公司（批號(hào)：CZ0036），谷丙轉(zhuǎn)氨酶（Alanine aminotransferase，ALT）、游離脂肪酸（Free fatty acids FFA）、組織樣本甘油三酯（Triglycerides，TG）測定試劑盒均購于南京建成生物工程研究所（批號(hào) ：C009-2，A042-2，F(xiàn)005-2）。（2）儀器：MR-4100酶標(biāo)儀購于美國Dynatech公司，全自動(dòng)樣品快速研磨儀購于上海凈信上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司，-80℃立式超低溫冰箱購于美國Thermo公司，Allegra? 64R低溫高速離心機(jī)購于美國Beckman公司，手掌式離心機(jī)，型號(hào)LX-100，購自海門其林貝爾儀器制造有限公司，移液槍購于德國Eppendorf公司。

1.3 NAFLD小鼠模型構(gòu)建 18只C57BL/6 雄性小鼠飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF環(huán)境中，動(dòng)物喂養(yǎng)在標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)籠里，飼養(yǎng)溫度為（22±2）℃，濕度為60%，光照12h/12h晝夜循環(huán)。所有小鼠適應(yīng)1周后隨機(jī)分為3組：正常對照（Ctrl）組（n=6）、高脂模型（HF）組（n=6）、高脂+丹酚酸A腹腔注射（HF+SAA）組（n=6）。Ctrl組采用普通飼料喂養(yǎng)，HF組及HF+SAA組采用HFD喂養(yǎng)：采用含60%脂肪的高脂飼料和含高果糖和高蔗糖的飲用水喂養(yǎng)，其中果糖含量為55%，蔗糖含量為45%，混合飲用水中共含有42g/L的碳水化合物，所有動(dòng)物自由飲食及取水。Ctrl組和HF組注射生理鹽水，HF+SAA組注射丹酚酸A 40mg/（kg·d），共喂養(yǎng)10周。造模結(jié)束后，小鼠禁食6h后，用10%水合氯醛麻醉，下腔靜脈取血，并收集小鼠組織樣本及糞便樣本，存放于-80℃立式超低溫冰箱。

1.4 檢測指標(biāo) （1）血清生化指標(biāo)檢測：造模結(jié)束后，用10%的水合氯醛將小鼠麻醉，采用下腔靜脈取血，將血漿放在冰塊上靜置30min后，用4℃離心機(jī)（3000 r/min）離心15min，取上清液。用ALT和TG試劑盒測得血清的ALT和TG含量。（2）肝臟生化指標(biāo)檢測：從-80℃冰箱取出肝臟組織后，置于全自動(dòng)樣品快速研磨儀研磨，研磨完全后用4℃離心機(jī)（12000 r/min）離心15min，取上清液。用組織樣本甘油酶法測定試劑盒測得三組肝臟TG含量。

1.5 腸道微生物菌群的測定 采集小鼠糞便樣本，裝入1.5ml無菌離心管，采用低溫運(yùn)輸（0℃）送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序。利用Illumina Miseq?高通量測序技術(shù)獲得小鼠糞便中16s rDNA V4區(qū)序列，并基于RDP數(shù)據(jù)庫對比分析Ctrl、HF和HF+SAA三組中每只小鼠糞便中細(xì)菌的種類和豐度。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用 SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件。對于各項(xiàng)連續(xù)型資料，先進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，如果每組均滿足正態(tài)分布且兩組間方差齊，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較；所有檢驗(yàn)均為雙側(cè)檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 丹酚酸A對高脂喂養(yǎng)小鼠的體重及能量攝入的影響 HF+SAA組采用40mg/（kg·d）劑量的丹酚酸A對HF組的小鼠進(jìn)行注射，結(jié)果顯示，丹酚酸A的注射不會(huì)影響小鼠日常食物的攝入量；與Ctrl組比較，HF組小鼠的體重明顯上升（P＜0.05），而HF+SAA組小鼠的體重相較于HF組明顯有下降（P＜0.05）。見表1和圖1。

表1 各組小鼠體重變化趨勢（±s）

表1 各組小鼠體重變化趨勢（±s）

注：與Ctrl組比較，*P＜0.05；與HF組比較，#P＜0.05

Ctrl組 HF組 HF+SAA組初始體重（g） 24.5±1.0 23.9±1.6 25.0±2.3最終體重（g） 31.6±2.2 44.1±3.5* 39.8±3.3#體重增加量（g） 7.0±1.5 20.2±2.4* 14.0±1.7#食物攝入量（g/d） 3.03±0.26 2.49±0.21 2.5±0.2

圖1 各組小鼠每周體重變化趨勢

2.2 丹酚酸A改善高脂飼料喂養(yǎng)的小鼠肝損傷 Ctrl組小鼠肝臟顏色鮮紅，邊緣銳利，而HF組的肝臟體積略增大，包膜緊張光滑，邊緣變鈍，顏色發(fā)黃，HF+SAA組小鼠的肝臟相較于HF組，顏色更鮮紅，邊緣較銳利（見圖2A）。Ctrl組小鼠肝臟組織細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞核大而圓，且居中。HF組小鼠肝臟細(xì)胞排列疏松，且細(xì)胞間出現(xiàn)脂滴。HF+SAA組小鼠與HF組比較肝臟細(xì)胞排列較緊密，脂滴明顯減少，細(xì)胞狀態(tài)接近于對照組（見圖2B）。

圖2 小鼠肝臟及肝臟HE染色圖

2.3 血清和肝臟中的生化指標(biāo) HF組小鼠肝臟中的TG含量明顯高于Ctrl組，而HF+SAA組小鼠肝臟中TG含量明顯低于HF組。HF組小鼠血清中的ALT、FFA和TG含量明顯高于Ctrl組（P＜0.05），HF+SAA組小鼠血清中的ALT、FFA和TG含量明顯低于HF組（P＜0.05）。見圖3。

圖3 血清和肝臟中的生化指標(biāo)

2.4 丹酚酸A對HFD小鼠腸道菌群的影響 根據(jù)16s rDNA測序結(jié)果顯示，在HFD喂養(yǎng)引起的NAFLD患者中，厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）仍是優(yōu)勢菌，但不同的研究中，其親和豐度和屬檢測有差異。而在本研究中，與Ctrl組比較，HF組Firmicutes明顯上調(diào)，Proteobacteria和Bacteroidetes顯著下調(diào)。HF+SAA組與HF組比較，F(xiàn)irmicutes有下降趨勢，Proteobacteria和Bacteroidetes顯著上調(diào)（見圖4）。

圖4 每組小鼠中各個(gè)菌群的分布情況

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，SAA能有效減輕由HFD引起的小鼠體重增加，并顯著改善HFD喂養(yǎng)小鼠肝臟的損傷及脂質(zhì)沉積，此外，SAA能顯著調(diào)控腸道菌群的結(jié)構(gòu)失衡，提示腸道菌群可能參與SAA保護(hù)HFD誘導(dǎo)的NAFLD。

NAFLD已成為全球最常見的肝臟疾病，其通常與肥胖、胰島素抵抗和代謝綜合征的發(fā)生密切相關(guān)。HFD誘導(dǎo)的肝脂肪變性模型被廣泛用于NAFLD的預(yù)防和治療的研究中，本資料結(jié)果顯示，HFD喂養(yǎng)10周后小鼠出現(xiàn)了嚴(yán)重的脂肪變性和肥胖，證明了NAFLD小鼠模型的成功建立，SAA是丹參主要成分之一，具有許多潛在的藥理活性，包括抗氧化、抗炎、抗纖維化和抗炎［7-11］，Ding等［12］研究結(jié)果首次證明SAA通過TXNIP/NLRP 3和TXNIP/ChREBP通路改善HFD誘導(dǎo)的肝臟脂質(zhì)積累和炎癥；王潤平等［13］發(fā)現(xiàn)，SAA能減緩HFD誘導(dǎo)的LDH、SOD的升高從而減輕NAFLD。在本研究同樣證實(shí)了SAA對HFD誘導(dǎo)的NAFLD的保護(hù)作用，SAA能夠降低HFD誘導(dǎo)的血漿中ALT、FFA和TG的增加，同時(shí)減輕了肝臟的脂質(zhì)沉積。這些結(jié)果均顯示SAA能有效阻止肝臟的脂肪變性。

人類腸道微生物群包含10～100萬億微生物，且腸道中的細(xì)菌數(shù)量顯著超過人體細(xì)胞總數(shù)［14］。已有研究表明，腸道和肝臟有多種相關(guān)的相互依賴性，腸-肝軸與NAFLD的進(jìn)展密切相關(guān)［15］。且有證據(jù)表明與無疾病的患者比較，NAFLD患者的腸道通透性顯著增加，NAFLD疾病與腸道菌群的變化顯著相關(guān)［16］。長期HFD改變了腸道菌群及腸道屏障功能，其將會(huì)引起肥胖及肥胖相關(guān)性脂肪肝疾病［17-18］。腸道菌群在NAFLD發(fā)病機(jī)制中的參與是復(fù)雜和多因素的［19-20］，目前為止，大多數(shù)研究均集中在微生物群的菌群結(jié)構(gòu)組成上，菌群中最常見的是Bacteroidetes和Firmicutes，而在NAFLD患者中，Bacteroidetes 和 Firmicutes仍然占主導(dǎo)地位，Mouzaki等［21］研究發(fā)現(xiàn)，HFD喂養(yǎng)后，在無菌小鼠體中接種Firmicutes組比接種Bacteroidetes組的體重、肝臟重量和肝臟脂肪顯著增加，Chen等［22］研究發(fā)現(xiàn)，NAFLD患者腸道菌群中Proteobacteria更豐富，其可能促進(jìn)腸道對脂質(zhì)的攝取。在本研究結(jié)果中同樣證實(shí)這個(gè)現(xiàn)象，HFD組中Firmicutes和 Bacteroidetes比例顯著高于對照組，而Proteobacteria表達(dá)豐度高于對照組。SAA干預(yù)組能顯著逆轉(zhuǎn)這類菌群結(jié)構(gòu)，降低了Firmicutes和 Bacteroidetes的菌群比例，并降低了Proteobacteria的豐度，預(yù)示SAA可能通過調(diào)控菌群的結(jié)構(gòu)從而影響NAFLD的進(jìn)展。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)SAA可能通過改善HFD誘導(dǎo)的NAFLD小鼠腸道菌群的結(jié)構(gòu)紊亂，進(jìn)而減輕NAFLD的病理現(xiàn)象，表明SAA對NAFLD的發(fā)生發(fā)展具有顯著的抑制作用，結(jié)果提示SAA可作為防治NALFD的潛在藥物，為臨床采用SAA治療 NAFLD 提供理論參考。