miR-363通過PDZD2對骨肉瘤細胞調控的分子機制研究

何帆 江武 丁國明 范小良 朱六龍

骨肉瘤的發病率約占原發惡性骨腫瘤的15%～23%［1］，是兒童和青少年癌癥死亡的主要原因。miR-363在多種類型的癌癥中表現出腫瘤抑制作用，而其在骨肉瘤中的抑制功能還需要進一步研究。PDZD2是促進胰島瘤細胞增殖的多PDZ結構域蛋白，研究發現其在前列腺癌（AIPC）中被激活，是一種6-PDZ結構的蛋白［2］。PDZD2在骨肉瘤發生中的作用目前仍不清楚。2016年12月至2019年3月作者通過實驗研究，分析miR-363和PDZD2在骨肉瘤細胞MG-63中的功能及其相互作用，探討miR-363對骨肉瘤細胞的調控作用及其分子機制。

1 材料與方法

1.1 細胞和試劑 骨肉瘤細胞株（MG-63，HOS和Saos2）和正常人成骨細胞株（hFOB1.19）均購自中國科學院上海細胞所。骨肉瘤細胞株用加入10%胎牛血清（FBS；美國Thermo Fisher Scientific公司）的DMEM培養基（美國HyClone公司），37℃和5%CO2濃度條件下培養。hFOB 1.19細胞用DMEM/Ham's F12培養基（DMEM/F12；1：1w/w混合物）在34℃，5%CO2濃度條件下培養。GAPDH抗體，E-鈣黏著蛋白抗體，增殖細胞核抗原（PCNA）抗體，caspase-3抗體和波形蛋白抗體購自美國Cell Signaling Technology公司；PDZD2抗體購自美國Abcam公司。miR-363模擬 物（5'-AAUUGCACGGUAUCCAUCU GUA-3'） 和陰 性 對 照（5'-UUCUCCGAACGUGU CACGUTT-3'）寡核苷酸序列購自上海吉瑪制藥技術有限公司。靶向 PDZD2（siRNA-PDZD2）的小干擾RNA（siRNA）（139，5'-GCUGAACUUUGCUGUGGGGAUU-3'；580，5'-CUCUG AACCAGGAGAAACAUU-3'； 和 1027，5'-GCUGGGAAUUCAGGUUAGUUU-3'），pcDNA 3.1-NEAT1和陰性對照購自廣州RiboBio 公司。PDZD2的psiCHECK2-UTR（野生型和突變型）由上海吉瑪制藥技術有限公司提供。

1.2 RNA分離和逆轉錄定量聚合酶鏈反應（RT-qPCR） 根據標準RNA分離方案，使用TRIzol試劑（美國Thermo Fisher Scientific公司）從組織或細胞系中提取總RNA。用于qPCR的反應條件如下：95℃，60sec；然 后95℃，5s進 行40循 環；然后60℃，34s。通過在ABI 7500快速序列檢測系統（美國Thermo Fisher Scientific公司）上使用SYBR Premix Ex Taq（大連Takara生物技術有限公司）對miR-363和PDZD2水平進行定量。將miR-363和PDZD2的水平分別標準化為U6和GAPDH的水平。引物分別為：miR-363，正向5'-ACACTCCA GCTGGGAATTGCACGGTATCCATC-3'和 反 向5'-CT CAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTAC AGATG-3'；U6，正向 5'-CTCG CTTCGGCAGCACA-3'和 反 5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'；PDZD2，正 向5'-TCTGTACTGTGTACCTCACCAA-3'和 反向 5'-CCCTGCGCTTTTCACCATAG-3'；GAPDH，正 向5'-TGTTCGTCATGGGTGTGAAC-3'和 反 向5'-ATGGCATGGACTGTGGTCAT-3'。使用公式 2-△△Ct（21）計算mRNA表達的相對倍數變化。

1.3 蛋白質印跡分析（Western blot） 用RIPA細胞裂解緩沖液（美國Santa Cruz Biotechnology公司）提取組織或細胞系中的總蛋白，并用BCA分析試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific公司）確定這些蛋白的濃度。每組蛋白質樣品（30μg）通過15%SDS-PAGE電泳，然后轉移到硝酸纖維素膜上（美國GE Healthcare），5%脫脂牛奶在室溫下封閉1h，用含0.1%Tween-20（TBST）的一抗，4℃孵育過夜。用TBST緩沖液洗滌，與二抗在室溫下孵育1h。最后，用ECL-Plus試劑（美國Millipore）觀察印跡。實驗用GAPDH作為對照。

1.4 免疫熒光試驗 采用免疫熒光試驗測定腫瘤細胞中E-鈣粘蛋白，波形蛋白和PDZD2的水平。用含4%多聚甲醛的PBS液固定細胞。將細胞在-20℃下用100%甲醇滲透10分鐘，用含3%牛血清白蛋白（BSA）的PBS液封閉60min，然后加入一抗，4℃，孵育過夜（抗PDZD2為美國Abcam公司產品，抗E-鈣粘蛋白為美國Cell Signaling Technology公司產品，抗波形蛋白為美國Cell Signaling Technology公司產品）。PBS沖洗，并置于蓋玻片上，與偶聯有熒光染料的二抗在室溫下于黑暗中孵育1h。用DAPI染色細胞核后，中性樹膠固定，并在FV10i共聚焦顯微鏡（日本Olympus Corporation）下觀察細胞。

1.5 免疫組化 采用免疫組化測定PDZD2在腫瘤中的表達。把切片在二甲苯中孵育5min，依次用100%和95%乙醇孵育10min，進行抗原暴露，然后在室溫下用3%過氧化氫將載玻片封閉30min。將切片與抗PDZD2的一抗在4℃孵育過夜，然后再接種抗二抗。使用EnVision檢測系統試劑盒（丹麥達格）評估免疫染色結果。

1.6 細胞轉染 接種MG-63細胞，用PBS洗滌細胞，分別用 miR-363 mimics（50nM），siRNA-PDZD2（1μg/ml）和相應的陰性對照（NC）轉染24、48和72h。轉染方法參照100 nM Lipofectamine 2000轉染試劑說明書（美國Thermo Fisher Scientific公司）。

1.7 CCK-8實驗檢測細胞活性 取轉染成功的MG-63細胞，按每1ml完全培養基加入10μl CCK-8將二者混合均勻后，每孔加入10μl CCK-8液，孵育1h，用酶標儀在450nm處測量吸光度。CCK-8試劑盒為日本Dojindo Molecular echnologies公司產品。

1.8 克隆形成能力檢測 取轉染后的單細胞懸液進行計數，將細胞懸液的細胞密度調整為1×103/ml；在培養板中分3種濃度接種細胞：分別接種50個細胞/孔、100個細胞/孔、200個細胞/孔；接種完畢后，所有孔中均補加培養基至液體量300μl/孔；在37℃、5%CO2條件下培養2～3周；定時觀察，當培養皿中出現肉眼可見的細胞克隆時，即終止培養。去除上清液，加4%多聚甲醛液固定細胞20min。用結晶紫染料進行細胞染色。染色成功后洗去未附著的染色液，細胞培養板置于空氣中自然晾干；最后拍照，計算細胞集落數。

1.9 細胞凋亡和細胞周期分析 Hoechst 33258檢測細胞凋亡：取轉染后的MG-63細胞，用4%低聚甲醛固定，將固定的細胞用0.1μg/ml的Hoechst 33258溶液（德國Sigma-Aldrich公司）染色，并在熒光顯微鏡（日本Olympus公司）下觀察核形態的變化，熒光的激發波長設定為460nm。流式細胞儀檢測細胞凋亡和細胞周期：流式細胞儀為美國BD公司產品。將2μl膜聯蛋白V與2μl碘化丙啶（PI）（美國Thermo Fisher Scientific公司）混合，每流式管加入1×105個細胞，避光孵育30min，上機檢測。TUNEL分析：將腫瘤組織用福爾馬林固定，石蠟包埋，4μm切片，使用細胞凋亡原位檢測試劑盒（日本和光純藥工業株式會社），按說明書對腫瘤切片進行染色。隨機選擇每個切片的五個非重疊視野，并在熒光顯微鏡下觀察。為確定細胞周期的相位分布，將細胞用PI染色液（10μg/ml RNase A；50μg/ml PI）在37℃下避光染色30min，然后使用流式細胞儀進行分析。

1.10 細胞侵襲能力檢測 Transwell小室試驗：將轉染后的MG-63細胞加入到含0.2%BSA的無血清培養基中，調整培養基中細胞的密度為2×105個/ml。取調整好的細胞懸液，加入到Transwell小室上孔中，每孔內接種2×104個細胞；然后再向Transwell小室的下室中加入含有10%FBS血清的完全培養基，每室加入700μl培養基。加注完成后將Transwell小室放入到二氧化碳細胞培養箱中，箱內條件為：5%CO2、37℃。培養48h后取出小室，將小室洗凈后，用結晶紫染色液進行染色。將小室用中性樹脂封片。在OLYMPUS CX41正置顯微鏡下觀察小室與拍照，觀察時每個小室選取4個視野進行測量，用IPP軟件進行細胞計數。每個實驗重復3遍。

1.11 動物模型試驗 將30只雄性小鼠（4～5周；20～22g；購自天津賽爾生物技術有限公司）置于25℃的無菌室中，進行12h的明/暗循環，并在室溫下滅菌，可自由進食、進水。準備已轉染miR-363mimics、miR-363（NC）和對照組人MG-63單細胞懸液，調整細胞濃度至1×107個/ml，每只裸鼠后脅腹部皮下注射50μl細胞混懸液（每組10只小鼠）。從第2周起測量腫瘤的大小，1次/隔3d，計算腫瘤體積：V（cm3）=寬度2（cm2）×長度（cm）/2。

1.12 統計學方法 PCR實驗數據按照2-△△Ct方法處理數據［3］。采用SPSS 19.0統計學軟件。計量資料以（±s）表示，兩組或多組間比較用t檢驗、單向方差分析或雙向方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 體外細胞試驗證實過表達miR-363可抑制骨肉瘤細胞的生長 發現miR-363在骨肉瘤細胞株中呈現低表達狀態，其中MG-63細胞的miR-363低表達與其他骨肉瘤細胞相比較顯著。Hoechst染色表明，過表達miR-363的MG-63細胞具有較高的凋亡率（見圖1）。流式細胞儀結果表明miR-363過表達可以誘導MG-63細胞中的G1/S阻滯（見圖2）。

圖1 Hoechst33258染色顯示miR-363過表達組細胞凋亡增多

圖2 流式細胞儀檢測顯示miR-363過表達組細胞中處于G1期的細胞數量增加，處于S期的細胞數量顯著減少

2.2 過表達miR-363可以調節上皮-間質轉化（EMT）表型，從而抑制骨肉瘤細胞的侵襲能力 Transwell小室試驗表明，miR-363過表達后，MG-63細胞的侵襲能力受到抑制（見圖3）。免疫熒光和蛋白質印跡分析結果顯示，miR-363過表達后，上皮標記E-鈣粘著蛋白的表達被上調，而間質標記波形蛋白（Vimentin）被下調，細胞增殖標志物PCNA的表達降低，而caspase-3的裂解增加。

圖3 miR-363過表達組細胞侵襲能力減弱

2.3 PDZD2是miR-363的直接靶標且可以在體外促進骨肉瘤細胞MG-63細胞增殖 本研究利用在線預測軟件miRWalk 尋找miR-363的潛在靶標，最后發現PDZD2為其靶基因。進一步分析發現PDZD2 mRNA的3'非翻譯區（UTR）具有miR-363的結合位點；因此，在骨肉瘤細胞中研究PDZD2與miR-363的相互作用。結果表明，MG-63細胞中miR-363的過表達顯著抑制其產生PDZD2 mRNA和蛋白的能力（見圖4）。為確認PDZD2是miR363的直接靶標，將具有PDZD2全長3'UTR（野生型或突變型）的螢光素酶報道載體轉染到MG-63細胞中，用雙螢光素酶試驗分析，結果發現，miR-363 mimics削弱野生型PDZD2 3'UTR的螢光素酶活性，但未影響對照組的突變型PDZD2 3'UTR，表明miR-363直接靶向骨肉瘤細胞中的PDZD2，以降低PDZD2蛋白水平（見圖5）。

圖4 免疫熒光檢測MG-63細胞中PDZD2的表達

圖5 用全長3'UTR轉染MG-63細胞（野生型和突變型）PDZD2，并使用螢光素酶報告基因法測定

2.4 骨肉瘤細胞中PDZD2蛋白水平降低的影響 在通過siRNA有效敲低MG-63細胞中PDZD2的表達后，測定細胞的凋亡，克隆形成能力和侵襲能力。結果表明，敲低PDZD2可以誘導細胞凋亡并減弱細胞的集落形成和侵襲能力。

2.5 miR-363通過下調體內PDZD2水平限制腫瘤生長 結果表明，注射過表達miR-363的MG-63細胞的小鼠發展出明顯較小的腫瘤，顯示出生長延遲（見圖6）。對腫瘤組織mRNA和蛋白質水平的檢測證實miR-363上調和PDZD2下調；通過檢測腫瘤細胞的凋亡率證明miR-363在體內顯著誘導骨肉瘤細胞的凋亡（見圖7）。這些調節作用與PCNA表達降低，caspase-3裂解增加及EMT表型受損有關（見圖8）。

圖6 miR-363 mimics組的裸鼠體內腫瘤生長速度較慢

圖7 TUNEL染色估算腫瘤切片中的細胞凋亡率（×200）

3 討論

骨肉瘤是一種間葉組織來源的惡性腫瘤。雖然對骨肉瘤形成過程中miRNA的致癌和抑癌功能已有相關文獻報道，但miRNA調控的靶基因等分子機制仍待研究。本研究通過體外和體內試驗發現，腫瘤抑制因子miR-363在骨肉瘤細胞中被下調并通過直接靶向PDZD2促進腫瘤生長。PDZD2最初被認為是一種癌基因，其表達在前列腺腫瘤細胞系和人原發性前列腺腫瘤中上調。本研究表明PDZD2表達與骨肉瘤進展有關。一項與腎細胞癌相關的單核苷酸多態性的最新研究表明，PDZD2的rs10054504與中國人群腎細胞癌的風險顯著相關［4］。本研究顯示，PDZD2的抑制促進骨肉瘤細胞的凋亡，并抑制骨肉瘤細胞系的遷移和侵襲能力。此外，PDZD2的敲低顯著降低細胞增殖標志物PCNA的表達，誘導caspase-3的裂解，并損害骨肉瘤細胞中的EMT表型。與miR-363/PDZD2相關的下游信號及其在骨肉瘤細胞中的功能有待進一步研究。

腫瘤發生期間miRNA的失調是惡性轉化的標志。抑癌基因miR-363屬于miR-92a家族，是一組高度保守的miRNA，包括miR-25，miR-92a-1，miR-92a-2和 miR-363［5］。已有研究顯示，miR-363-3p在具有淋巴結轉移的結直腸癌（CRC）組織標本中被下調，從而通過增加體內和體外SRY-box 4（Sox4）的表達促進CRC細胞的遷移、侵襲并誘導EMT［6］。在前列腺癌中，PC-3細胞中高水平的miR-363通過靶向抑制MYC原癌基因來促進細胞增殖，誘導細胞轉化并促進EMT［7］。目前研究表明，骨肉瘤細胞中的miR-363水平被下調，進而導致其靶基因PDZD2的表達上調。在骨肉瘤細胞中恢復miR-363表達會損害細胞活力，集落形成，遷移和侵襲，同時通過PDZD2誘導凋亡和細胞周期停滯。這些影響可能與PCNA，caspase-3和EMT表型的降低有關。同樣，Wang等［8］研究認為，miR-363通過靶向SOX4抑制骨肉瘤細胞的增殖和侵襲。表明，miR-363可以在多種類型的癌癥中充當通用的腫瘤抑制因子。總之，PDZD2作為骨肉瘤細胞中抑癌基因miR-363的新靶標；miR-363的過表達或PDZD2的抑制可促進caspase-3相關腫瘤細胞凋亡，抑制EMT，并誘導骨肉瘤消退。