響應面法優化微波輔助提取節節草中的多糖

潘樂， 魏濤， 孫麗莉， 吳進， 劉華敏

（1.黃山學院 化學化工學院， 安徽 黃山245041； 2.安徽中煙工業有限責任公司技術中心， 安徽 合肥230088）

0 引言

節節草（Equisetum ramosissimumDesf.）為木賊科多年生草本植物，在《中國藥典》2010 版中學名為木賊，其含有多糖、黃酮及生物堿等有機活性成分［1］. 已經報道證實其有清熱解毒、降火清淤、降血脂、保護血管等作用，是一種極有前景的天然中草藥［2］. 國內外學者對木賊科植物的有機活性成分進行了研究［3］. 天然多糖具有抗氧化、防衰老、降血壓、降血脂及抗腫瘤等功效，因而受到了業界人士的廣泛關注. 多糖主要來源于天然植物之中，現已知曉可以從貢菊［4］、南瓜［5］、筋骨草［6］等植物中提取多糖. 主要提取的方法有水熱法、酶解法、超聲波輔助提取、微波輔助提取、超臨界流體萃取等提取方法［7］.

微波輔助提取法是一種新型高效的天然產物提取方法，相比于傳統的熱水浸取法，微波輔助提取具有耗時短、效率高、能耗少等優點. 已有報道微波可以提取板栗淀粉［8］、芒果片多酚［9］、艾葉總黃酮［10］等天然活性物質. 然而，現階段還未見有微波輔助提取節節草中多糖的報道. 本實驗研究采用高效的微波提取技術提取節節草中的多糖工藝. 實驗在單因素試驗的基礎上，利用響應面法優化微波輔助提取節節草中的多糖，從而得到微波輔助提取的最優工藝.

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

2018 年9 月22 日通過“淘寶”購于皇冠店“亳州市九林中藥材銷售公司”，經黃山學院生命與環境科學學院吳永祥副教授鑒定為節節草樣品. 將采購的樣品放入烘箱中干燥后放入到中藥粉碎機中粉碎，過篩（100 目）. 稱取一定量的節節草粉末，按料液比為1∶20 的比例加入無水乙醇浸泡1 h 進行脫脂，然后將樣品抽濾，烘干至恒重. 將粉末收集到廣口瓶中密封保存，備用.

葡萄糖、無水乙醇、正丁醇、三氯甲烷為分析純，購于國藥集團化學試劑公司； 濃硫酸為分析純，購于西隴化工股份有限公司； 苯酚為分析純，購于宜興市化學試劑有限公司； 水為超純水. GZX－9030 MBE 電熱鼓風干燥機，MAPADA UV－1100 紫外分光光度計，FA12048 電子分析天平，XH100B 微波催化合成萃取儀，XFB－1000 中藥粉碎機，RE－52AA 旋轉蒸發器.

1.2 節節草多糖含量的測定

移取1.00 mL 節節草多糖提取液于50 mL 燒杯中. 移取6 mL 去離子水于燒杯中進行稀釋，攪拌均勻后移取多糖稀釋液1.00 mL 于50 mL 具塞試管中. 按次序先后加入1 mL 5%苯酚和5 mL 濃硫酸，搖勻后置于水浴鍋中，60 ℃水浴10 min. 待顯色反應完成后，紫外分光光度計在波長為490 nm 處測試待測液體的吸光度值，該過程利用去離子水為參比溶液進行校零. 節節草多糖的提取按公式（1）計算：

式中：S為節節草多糖提取質量分數／（mg／g）；ω為溶液質量濃度／（mg／mL）；V為液體體積／mL；N為樣品稀釋倍數；m為節節草樣品質量／g.

1.3 節節草多糖提取最優條件的確定

在單一變量的條件下分別研究提取溫度（30、40、50、60、70、80 ℃），料液比（1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1 ∶60 g／mL），微波時間（5、10、15、20、25 min），微波功率（200、300、400、500、600、700 W）對節節草多糖提取率的影響. 在單因素實驗的基礎上對節節草多糖提取率的3 個因素料液比、微波時間和微波功率進行編碼. 通過Design－Expert 10 軟件進行分析和優化.

1.4 紅外光譜表征

將微波輔助提取得到的節節草多糖溶液加入到旋轉蒸發儀中，加熱濃縮至一定量后倒入分液漏斗中，按體積比為（1∶4）的比例加入Sevage 試劑，劇烈振蕩后除去2 層液體中間物質，重復多次完成除蛋白. 按1∶1 的比例往除去蛋白質后的節節草多糖溶液加入無水乙醇，然后將樣品液進行過濾后放入鼓風干燥箱烘干至恒重. 取少量處理后得到的節節草多糖，與干燥的溴化鉀粉末混合，在瑪瑙研缽中研磨均勻，壓片后使用紅外光譜儀掃描32 次，得到微波提取節節草多糖的紅外光譜圖.

2 結果與討論

2.1 微波輔助提取條件的確定

預實驗結果顯示，對于微波輔助提取節節草中的多糖影響因素有料液比、微波溫度、微波時間等. 對料液比、微波溫度、微波時間分別進行單因素實驗，獲得最佳單因素提取條件為料液比1∶50 g／mL，提取時間15 min，溫度60 ℃. 由于節節草多糖的提取會受到這些因素的相互影響，因此根據響應面優化方法，利用單因素實驗的結果和Box－Benhnken 的中心組合設計原理［10］，確定節節草多糖提取工藝響應面分析的變量因素編碼和水平如表1.

表1 響應面分析因素和水平

按表1 的分析因素和水平，利用Design－Expert 10 軟件進行節節草多糖提取工藝實驗設計，共設計17 個實驗點，得到實際結果如表2 所示.

表2 響應面實驗設計與結果

2.2 模型方程的建立與顯著性檢驗

利用Design－Expert 10 軟件將表2 實驗數據進行響應面分析：以節節草多糖提取率（Y）為效應值，分別對微波溫度為（A），微波時間為（B），料液比為（C）3 個因素進行多元回歸擬合，發現用二次階多項式回歸最優，軟件得到的二次回歸方程模型為

對擬合方程進行方差分析，結果見表3.

表3 回歸模型方差分析結果

由表3 可以看出，該模型F＝30.18，P＜0.000 1，表明模型極顯著. 模型的決定系數R2＝0.974 9，說明該模型與實際實驗擬合較好，各個自變量與提取率響應值之間線性系顯著. 因此，該回歸方程對實驗擬合情況較好，實驗誤差小，可以較好地描述各因素和響應值之間的真實關系.

從系數項P值來分析，方程的一次項C、交互項AC、二次項A2和B2都達到極顯著水平，說明試驗各個因素對響應值的影響并非簡單的線性關系［11］.

F值可以反映各實驗因素對實驗指標的重要性，F值越大，表明對實驗指標的影響越大； 從表3 可知，C＞A＞B，所以各個單因素對節節草多糖提取率的影響為料液比＞溫度＞時間.

2.3 微波輔助提取工藝的響應面交互作用分析

節節草多糖提取率（Y）與自變量三維響應曲線面，如圖1 所示. 微波溫度（A）與微波時間（B）的底面等高線密度相差不大，表明AB的交互作用對微波提取節節草多糖的影響不夠顯著； 微波溫度（A）與料液比（C）之間底面等高線密度最大，表明AC的交互作用對節節草多糖提取率的影響顯著； 料液比（C）與微波時間（B）的底面等高線密度相差不大，表明BC的交互作用對節節草多糖提取率影響不夠顯著. 這與表3 中方差分析結果一致. 對模型方程求一階偏導可得模型的最佳提取條件為：微波溫度49.70℃，料液比1∶46.65 g／mL，提取時間15.55 min，微波提取節節草多糖的理論提取質量分數為4.188 98 mg／g.

圖1 節節草多糖提取的三維響應面曲線面

2.4 響應面優化的最優提取條件的驗證

根據Design－Expert 8.0.6.1 軟件得到的數據回歸方程結合實際情況可以得到的最佳提取工藝條件為：料液比1∶46.65 g／mL、微波溫度49.70 ℃，微波時間15.55 min. 在上述的條件下多糖的理論提取率為4.19%，考慮到實際操作的便利，將提取最佳條件修正為料液比為1∶47 g／mL，提取時間為15 min，微波溫度為50 ℃，平行實驗3 次，多糖提取率為4.16%. 與預測值為4.19%相比，得到的實際測量值與理論值之間相對誤差為－0.72%，表明實驗結果與軟件模擬給出的預測相一致.

圖2 微波提取節節草多糖的紅外光譜圖

2.5 紅外光譜分析

最佳條件提取的節節草多糖，經過除蛋白和醇沉進行純化處理，獲得的樣品干燥后測得其紅外光譜如圖2.從圖2 可以看出3 450 cm－1和2 930 cm－1應該分別屬于節節草多糖－OH和C－H的伸縮振動吸收峰.1 732 cm－1、1 630 cm－1的吸收峰應歸屬于節節草多糖的羧基（COO－）的伸縮振動. 紅外光譜的結果與多糖的主要官能團特征一致，結合節節草微波提取物可以采取苯酚－硫酸法進行顯色的特征，可以確定微波提取的節節草成分應為多糖類物質.

3 結論

本實驗利用微波輔助提取節節草中的多糖，選取料液比、微波時間、微波溫度3 個因素進行單因素實驗.根據單因素實驗的結果，利用計算機軟件Design－Expert 進行響應面法設計，優化了節節草多糖提取工藝. 模型的決定系數R2＝0.974 9，說明該模型與實際實驗擬合較好，自變量與響應值之間線性關系顯著. 通過模型設計和實驗探討，確立了微波輔助節節草中多糖的最佳提取工藝：料液比為1∶47 g／mL，提取時間為16 min，微波溫度為50 ℃. 該方法對節節草中多糖成分的提取和在食品、藥品領域的應用研究具有一定的借鑒作用.