玉竹黃酮提取純化及體外抗氧化研究

李素紅，江明珠，姜曉坤,2，李天嬌,2，李鳳林,2，程碧君,2*

（1.吉林農業科技學院食品工程學院，吉林吉林 132101；2.吉林省釀造技術科技創新中心，吉林吉林 132101）

玉竹又稱尾聲、鈴鐺菜、竹根七、田草根等，為百合科黃精屬多年生草本植物，廣泛分布于我國北方、東部和中部，其中吉林、陜西等省均有大面積人工種植。新鮮的玉竹根部是淺黃色或淺白色，干燥后為棕黃色或深棕色。玉竹是一種藥食同源植物，干燥的根莖是我國常用的中藥材之一，具有潤燥、養陰、除煩祛暑、止渴等作用。玉竹中的活性物質主要有多糖、黃酮、皂苷、生物堿等，現代藥理學研究發現，玉竹及其提取物有抗衰老、抗氧化、降血脂、降血糖、改善心血管疾病等多種功效[1-2]。因此近年來玉竹研究成為熱點。

黃酮類化合物是某一類具有相同或相似化學結構和活性物質的天然化合物的統稱，自然界中分布廣泛，在蔬菜、水果的根莖葉中均有存在[3]。黃酮類化合物也是一類天然色素，在植物中有一定的含量[4]。黃酮類化合物具有保護心血管、抗炎以及保肝的功效，還具有抗氧化性，能夠抑制細胞的退化、衰老[5]。因此，對黃酮類化合物的研究成為國內外天然藥物開發和研究的熱點，但目前玉竹黃酮提取及純化方面的文獻報道很少。本試驗以玉竹為研究對象，采用超聲波輔助法提取黃酮，經過單因素和正交試驗，得出最佳提取工藝；在此基礎上，采用D-101 大孔樹脂對玉竹粗黃酮進行純化，主要以黃酮吸附速率和解吸速率作為純化的指標；采用清除自由基試驗來判定純化后玉竹黃酮的抗氧化性，為玉竹黃酮的大規模開發利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 原料與試劑

三年生圓葉玉竹，由吉林農業科技學院食品工程學院基地提供；亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、乙醇、鹽酸、水楊酸、VC、FeSO4由食品工程學院理化實驗室提供；98%蘆丁標準品（153-18-4）購自圖林實驗耗材（南昌）；DPPH、Tris-HCl 緩沖溶液購自沃瑞達斯實驗試劑耗材（南京）；大孔樹脂購自凱威化工專供店（杭州）；鄰苯三酚，購自安吉達實驗科技公司（青島）。

1.1.2 儀器與設備

F-008S 超聲波清洗器，蘇州邁弘電器有限公司；V-T5/PC 紫外可見分光光度計，屹譜儀器制造有限公司；BO-150P2 粉碎機，永康市鉑歐五金制品有限公司；FA1004 電子分析天平，寧波市江東歐億檢測儀器有限公司；TG18-WS 離心機，長沙湘銳離心機有限公司。

1.2 方法

1.2.1 玉竹黃酮的提取及測定

（1）玉竹黃酮的提取

新鮮玉竹切成薄片、放入60 ℃烘箱，烘干至恒質量，取出用粉碎機粉碎，過60 目篩備用。稱取玉竹粉末，分別放置在不同的錐形瓶中，選用不同的乙醇濃度、料液比和超聲時間，在超聲波清洗器中提取。提取完成后，置于離心機中離心，澄清后取上清液。

（2）標準曲線的繪制

在50 mL 容量瓶加入10 mg 蘆丁標準品，再加入50%乙醇至刻度線，將蘆丁對照品溶液的濃度配置為0.2 mg/mL[6]。取6 個50 mL 容量瓶，標號為A～F，A 號容量瓶做空白對照，其他依次加入蘆丁溶液2、4、6、8、10 mL，每個容量瓶中加入0.4 mL NaNO2（5%）溶液，混勻，放在實驗臺上靜置6 min 后，加入0.4 mL Al(NO3)3（10%）溶液，混勻，繼續靜置6 min，在每個容量瓶中加入4 mL NaOH（4%）溶液，并用50%乙醇定容，混勻，繼續放置15 min，在波長512 nm 處測吸光度，制作標準曲線[7]。

（3）玉竹黃酮總含量的測定

玉竹黃酮質量及得率的計算公式見式（1）（2）。

式中，c-提取液黃酮的濃度，mol/L；V1-提取液的總體積，mL；V2-制備供試液溶液定容體積，mL；V3-量取用于制備供試液溶液體積，mL；m0-總黃酮質量，mg；m1-玉竹粉的質量，g。

（4）單因素試驗

稱5.0 g 玉竹粉末，放置在錐形瓶中，分別設計不同試驗因素：乙醇濃度（30%、40%、50%、60%、70%），液料比（5:1、10:1、15:1、20:1、25:1，mL/g），超聲時間（10、20、30、40、50 min），超聲功率（40、60、80、100、120 W），分析各因素對玉竹黃酮提取率的影響，在此基礎上，采用正交試驗優化提取工藝。

（5）正交試驗

根據單因素得出最佳結果，進行四因素三水平的正交試驗；根據玉竹黃酮的提取率確定最佳提取條件。正交試驗設計見表1。

表1 超聲法提取玉竹黃酮正交試驗設計Table 1 Orthogonal design of ultrasonic extraction of flavonoids from Polygonatum odoratum

1.2.2 玉竹黃酮的純化

（1）樹脂的預處理

根據鐘方麗等[8]的純化工藝，確定采取D-101 型大孔樹脂進行純化。將準確稱量的大孔樹脂加入錐形瓶中，并加入95%乙醇浸泡4 h，倒出浸泡液，再用純凈水清洗，要求洗出液澄清無混濁，且呈中性后備用。

吸附率、解析率的計算公式見式（3）（4）。

式中，c0-吸附之前的濃度，mol/L；c1-吸附之后的濃度，mol/L；c2-解析之后的濃度，mol/L。

（2）試驗設計

取備用玉竹黃酮溶液，分別設計不同試驗因素：吸附pH（6、7、8、9、10），吸附時間（1、2、3、4、5 h），吸附液料比（5:1、10:1、15:1、20:1、25:1，mL/g），不同乙醇用量（10、15、20、25、30 mL），對玉竹黃酮進行純化，按上述方法測定吸光度，通過對玉竹黃酮吸附率和解析率的影響來確定最佳的純化條件。

1.3 體外抗氧化研究

1.3.1 清除DPPH 自由基

稱量7.96 mg DPPH 放在100 mL 容量瓶里，再加入50%乙醇至刻度線，配成濃度為0.2 mo1/L 的DPPH 溶液，放置在黑暗的地方保存（0～4 ℃）。向5 支干凈試管中加入5 mL 事先準備好的不同濃度梯度的玉竹黃酮溶液，依次加入5 mL DPPH 溶液，混合均勻后放置在黑暗中30 min，測定吸光度為A1；另取5 支試管分別加入5 mL、50%乙醇溶液，分別向試管中加入不同濃度的玉竹黃酮溶液5 mL，混合均勻后放置在黑暗中30 min，測吸光度為A2，再拿1 支試管，放入5 mL DPPH 溶液和5 mL、50%乙醇溶液，混勻后放置在黑暗中30 min，測定吸光度為A0[9-10]。以相同濃度的VC 代替玉竹黃酮溶液進行對照試驗。清除率的計算公式見式（5）。

1.3.2 清除超氧陰離子自由基

取5 支潔凈試管放在25 ℃恒溫水浴鍋里，加入4.5 mL Tris-HCl 緩沖溶液（0.05 mol/L、pH=8.0），水浴20 min，然后加入不同濃度的玉竹溶液2 mL 及鄰苯三酚1 mL（30 mmol/L），混勻，水浴8 min，再加入12 mol/L 鹽酸2滴，10 min 后在320 nm 測吸光度A1；另取5 支試管按上述的方法操作，將Tris-HCl 緩沖溶液換成蒸餾水，其余的條件不變，在320 nm 測吸光度A2；再另取1 支試管將玉竹溶液換成蒸餾水，其余條件不變，測定吸光度為A0[11-12]。以相同濃度的VC 代替玉竹黃酮溶液進行對照試驗，清除率的計算公式見式（6）。

1.3.3 清除羥基自由基

吸取不同濃度的玉竹溶液2 mL，分別加入5 支干凈的試管，然后依次加入6 mmol/L FeSO42 mL，0.3%H2O22 mL，混勻放置10 min，加入2 mL 6 mmol/L 水楊酸，混勻后在30 ℃恒溫水浴鍋中靜置30 min，測定吸光度為A1，另取5 支試管將H2O2換成蒸餾水，則其余條件不變，測定吸光度為A2，再另取1 支試管將玉竹溶液換成蒸餾水，則其余條件不變，測定吸光度為A0[13]。以相同濃度的VC 代替玉竹黃酮溶液進行對照試驗。清除率的計算公式見式（7）。

2 結果與分析

2.1 制作標準曲線

以蘆丁對照品溶液的吸光度值為縱坐標，質量濃度（mg/mL）為橫坐標，繪制標準曲線，得回歸方程Y=0.0503X-0.038 9，R2=0.997 9。結果表明，蘆丁在范圍內呈良好的線性關系。

2.2 提取玉竹黃酮

2.2.1 不同濃度乙醇對玉竹黃酮提取率的影響

由圖1 可以看出，玉竹中黃酮的提取率隨著乙醇濃度的增加先增加后減少，當乙醇濃度為40%時，玉竹黃酮提取率最高，為0.616 2%。

2.2.2 不同液料比對玉竹黃酮提取率的影響

由圖2 可知，隨著液料比的增加，玉竹黃酮提取率先增加后減少，當液料比為10:1（mL/g）時，黃酮的提取率最高，為0.458 2%。

2.2.3 不同超聲時間對玉竹黃酮提取率的影響

由圖3 可以看出，黃酮的提取率隨著超聲時間的增加先升高后急劇下降。當超聲時間為40 min 時，玉竹黃酮的提取率最高，為0.445 2%

2.2.4 不同超聲功率對玉竹黃酮提取率的影響

由圖4 可以看出，黃酮的提取率隨著超聲功率的增加先上升后下降，當超聲功率為80 W 時，提取率最高，為0.598 3%。

2.2.5 玉竹黃酮超聲波輔助提取的正交試驗結果

從表2 得出，影響玉竹黃酮提取率的因素為D＞A＞B＞C，即超聲功率影響最大，超聲時間影響最小；提取最佳條件是A3B1C3D2，即乙醇濃度為45%，液料比為7:1（mL/g），超聲時間為45 min，超聲功率80 W，提取率為0.517 4%。

表2 超聲法提取玉竹黃酮正交試驗結果表Table 2 Orthogonal test for extraction of flavonoids from Polygonatum odoratum by ultrasonic method

2.3 玉竹黃酮的純化試驗

2.3.1 不同pH 對玉竹黃酮吸附率的影響

由圖5 可以看出，吸附液中pH＜8 時，玉竹中黃酮的吸附率隨著pH 的增加而持續提高；當pH＞8 時，黃酮的吸附率隨pH 的增加而急劇下降。因此，綜合考慮選擇pH8 較佳。

2.3.2 不同吸附時間對玉竹黃酮吸附率的影響

由圖6 可以看出，吸附時間為3 h 時，玉竹黃酮的吸附率隨時間的增加而持續提高；當時間大于3 h 時，黃酮的吸附率隨著時間的增加而急劇下降。因此，綜合考慮吸附時間選擇3 h。

2.3.3 不同液料比對玉竹黃酮吸附率的影響

由圖7 可以看出，當液料比小于15:1（mL/g）時，玉竹中黃酮的吸附率隨著吸附液料比的增加而持續提高；當吸附液料比大于15:1（mL/g）時，黃酮的吸附率隨著吸附液料比的增加而急劇下降。因此，綜合考慮液料比選擇15:1（mL/g）。

2.3.4 不同乙醇用量對玉竹黃酮解析率的影響

由圖8 可以看出，解析液中乙醇用量小于20 mL時，玉竹中黃酮的解析率隨著乙醇用量的增加而持續提高；當乙醇用量大于20 mL 時，黃酮的解析率隨著乙醇用量的增加而急劇下降。因此，綜合考慮乙醇用量選擇20 mL。

2.4 玉竹黃酮體外抗氧化試驗

2.4.1 DPPH 自由基清除能力測定

由圖9 可知，在玉竹黃酮的不同濃度條件下，清除率呈現良好的上升狀態，并無拐點出現。與VC 相比，玉竹黃酮清除DPPH 的效果稍好。由此可知，玉竹黃酮有較強的清除DPPH 自由基的能力。

2.4.2 超氧陰離子自由基清除能力測定

由圖10 可知，在玉竹黃酮的不同濃度條件下，清除率呈現良好的上升狀態，并無拐點出現。與VC 相比，玉竹黃酮清除超氧陰離子的效果要好。可見，玉竹黃酮對超氧陰離子自由基有較好的清除能力。

2.4.3 羥基自由基清除能力測定

從圖11 可知，在玉竹黃酮不同濃度的條件下，清除率呈現良好的上升狀態，并無拐點出現。與VC 相比，玉竹黃酮VC 清除羥基自由基的效果要稍好。由此可知，玉竹黃酮溶液對羥基自由基具有較好的清除能力。

3 結論

本試驗選用玉竹為原材料，使用超聲波輔助法提取玉竹黃酮，試驗得出最佳工藝條件為乙醇濃度45%，料液比7:1（mL/g），超聲時間45 min，超聲功率80 W，此條件下黃酮提取率達到0.517 4%。采取D-101 大孔樹脂純化粗玉竹黃酮溶液，最優純化工藝為pH 8，吸附時間3 h，吸附料液比15:1（mL/g），乙醇用量20 mL。通過對玉竹黃酮抗氧化能力的測定，得出玉竹黃酮溶液具有抗氧化的能力，這為玉竹黃酮的抗氧化性試驗提供了指導，為抗氧化產品的開發提供了技術依據，也為當地玉竹資源的合理開發提供了一條有效的途徑。