蘆薈苷對糖尿病腎病大鼠NOX4 / ROS / p38 MAPK信號通路及足細胞功能的影響

馬冰沁,錢唯韻,羅振國,汪良芝

(常州市第一人民醫(yī)院 全科醫(yī)學科,江蘇 常州 213000)

糖尿病腎病( diabetic nephropathy,DN) 是高血糖引發(fā)的腎小球病變,若不及時干預(yù),患者進展為終末期腎病[1],嚴重影響患者健康和生命安全。 DN中高血糖可引起機體發(fā)生氧化應(yīng)激、細胞因子表達異常,腎組織炎癥反應(yīng)加劇、糖脂代謝發(fā)生紊亂等癥狀,目前主要采用降血糖降脂方法治療DN[2-3],但無法從根本上抑制DN 疾病進展。 蘆薈苷作為中藥蘆薈的主要成分,具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗炎、降血糖等多種藥理學作用,在脊髓缺血/ 再灌注大鼠模型中可抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)實現(xiàn)對大鼠的保護作用[4],但蘆薈苷對DN 的作用尚不明確。本研究采用高糖高脂、 鏈脲佐菌素( streptozocin,STZ)誘導(dǎo)建立DN 大鼠模型,探討蘆薈苷對DN 足細胞的影響,并初步探討其機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

63 只健康SD 大鼠,購自北京維通利華實驗動物科技有限公司[ SCXK( 京) - 2018 - 0021],體重180～220 g,SPF 級。 實驗動物在本院動物中心暫養(yǎng)[SYXK(京)-2017-0003],暫養(yǎng)期間均自由飲水飲食,溫度(24±1)℃、(12 / 12) h(光照/ 黑暗) 常規(guī)飼養(yǎng)。 所有動物實驗均經(jīng)本院動物實驗倫理委員會審核并批準(IACUC-2017-0151)遵循3R 原則。

1.2 主要試劑與儀器

STZ(美國sigma 公司,貨號:S0131);格列喹酮片(糖適平)(北京萬輝雙鶴藥業(yè)有限責任公司,批準文號:國藥準字H10940258);蘆薈苷(成都德斯特生物科技有限公司,產(chǎn)品目錄號:DL0097);白介素-1β( Interleukin-1β, IL-1β)、 腫 瘤 壞 死 因 子- α(Tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)、酶聯(lián)免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA) 試劑盒、一抗尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase 4,NOX4)、p38 絲裂原活化蛋白激酶( p38 mitogenactivated protein kinase, p38 MAPK)、 phospho-p38 MAPK、Nephrin、Podocin、GAPDH,二抗羊抗兔(美國abcam 公 司, 貨 號 分 別 為: ab100768、 ab100785、ab133303、 ab170099、 ab4822、 ab227806、 ab181143、ab181602、ab96587); 超氧化 物歧化 酶( superoxide dismutase, SOD ) 活 性 檢 測 試 劑 盒、 丙 二 醛(maleicdialdehyde, MDA) 試劑盒、 活性氧( reactive oxygen species,ROS) 檢測試劑盒(碧云天生物科技有限公司,貨號分別為:S0103、S0131、S0033);血糖儀( 歐姆龍,型號:HGM-114);蛋白凝膠成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司,型號:5200)。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組及給藥處理

參照文獻[5]構(gòu)建DN 大鼠模型,實驗前檢測每只大鼠尿蛋白、尿糖水平,均正常。 STZ 溶于0.1 mol/ L 檸檬酸鹽緩沖液備用。 高糖高脂飼料(18%蔗糖、9%蛋黃粉、8%豬油、1%膽酸鈉、64%基礎(chǔ)飼料)飼養(yǎng)大鼠4 周,禁食12 h,各組腹腔注射40 mg /kg STZ,72 h 后采集尾靜脈血,檢測血糖水平,空腹血糖≥16.7 mmol/ L 則造模成功,55 只大鼠造模成功40 只,造模成功后隨機分為模型組、陽性對照組、(低、中、高)劑量實驗組,每組8 只;正常組飼喂基礎(chǔ)飼料,腹腔注射等體積0.1 mol/ L 檸檬酸鹽緩沖液。 陽性對照組根據(jù)人與動物體表面積和體重換算,大鼠灌胃9.45 mg /(kg·d) 糖適平;(低、中、高)劑量實驗組分別灌胃10、20、40 mg /(kg·d)蘆薈苷,正常組、模型組灌胃等體積蒸餾水,連續(xù)6 周。

1.3.2 樣品采集

給藥前與給藥后均采集尾靜脈血,部分用于檢測血糖水平,部分室溫靜置2 h,3000 r/ min 離心10 min 收集血清,置于-20℃冰箱待用。 立即處死大鼠,摘取腎,部分置于4%多聚甲醛中固定,部分置于-80℃冰箱待用。

尾靜脈血采血后用血糖儀檢測空腹血糖水平。

1.3.3 ELISA 檢測血清中IL-1β、TNF-α 水平

-20℃冰箱取出血清, 嚴格按照大鼠IL-1β、TNF-α ELISA 試劑盒說明檢測血清中IL-1β、TNF-α水平。

1.3.4 HE 檢測大鼠腎組織形態(tài)

4%多聚甲醛固定24 h,取出腎組織,切片(厚度:6 μm)后蘇木精染色、乙醇伊紅復(fù)染,乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片,光學顯微鏡拍照。

1.3.5 腎組織中SOD、MDA、ROS 檢測

- 80℃冰箱取部分腎組織, 研磨充分, 按照SOD、MDA、ROS 試劑盒說明書步驟檢測腎中SOD、MDA、ROS 水平。

1.3.6 蛋白免疫印跡檢測腎組織中NOX4、 p38 MAPK、phospho-p38 MAPK、Nephrin、Podocin 水平

-80℃冰箱中取出腎組織,每組稱重50 mg,冰上研磨,蛋白提取試劑盒提取各組大鼠組織總蛋白,凝膠電泳分離蛋白,轉(zhuǎn)至PVDF 膜上;5%脫脂奶粉封閉2 h; 分別加入一抗NOX4、 p38 MAPK、phospho-p38 MAPK、 Nephrin、 Podocin、 GAPDH, 4℃孵育過夜;加入對應(yīng)二抗,室溫孵育1 h;化學發(fā)光法顯影,凝膠成像系統(tǒng)對條帶進行灰度分析。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 25.0 軟件進行統(tǒng)計學分析,計量數(shù)據(jù)均采用平均數(shù)±標準差(± s )表示,多組間比較行單因素方差分析,進一步兩兩比較行SNK-q 檢驗。 P<0.05,差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 蘆薈苷對大鼠血糖的影響

給藥前,與正常組相比,模型組、陽性對照組、(低、中、高) 劑量實驗組空腹血糖水平升高( P <0.05)。 給藥后,與正常組相比,模型組空腹血糖水平升高(P<0.05);與模型組相比,陽性對照組、(低、中、高)劑量實驗組空腹血糖水平降低(P<0.05)。 與給藥前相比,給藥后陽性對照組、(低、中、高)劑量實驗組空腹血糖水平降低(P<0.05)。 見表1。

2.2 蘆薈苷對大鼠血清中IL-1β、TNF-α 的影響

與正常組相比,模型組血清中IL-1β、TNF-α 水平升高( P < 0.05); 與模型組相比, 陽性對照組、(低、中、高) 劑量實驗組血清中IL-1β、TNF-α 水平降低(P<0.05)。 見表2。

2.3 蘆薈苷對大鼠腎組織形態(tài)的影響

正常組腎組織形態(tài)正常,結(jié)構(gòu)清晰,腎小球、腎小管形態(tài)規(guī)則,腎小球、腎小管管腔未見擴張;模型組腎小球肥大,系膜增厚和腎小球基底膜增厚,間質(zhì)炎癥浸潤;陽性對照組腎小球肥大現(xiàn)象得到緩解,系膜輕度增厚,未發(fā)現(xiàn)炎癥細胞浸潤;(低、中)劑量實驗組隨著劑量增加,腎小球肥大現(xiàn)象逐漸緩解,腎小球系膜輕-中度增生,腎小管擴張;高劑量實驗組與正常組腎組織結(jié)構(gòu)類似。 見圖1。

2.4 蘆薈苷對大鼠腎組織中SOD、MDA、ROS 水平的影響

與正常組相比, 模型組腎組織中SOD 水平、SOD/ MDA 降低(P<0.05),腎組織中MDA、ROS 水平升高(P< 0.05); 與模型組相比, 陽性對照組、(低、中、高)劑量實驗組腎組織中SOD 水平升高(P<0.05),MDA 水平降低(P< 0.05);陽性對照組、(中、高) 劑量實驗組SOD/ MDA 升高(P< 0.05),ROS 水平降低(P<0.05)。 見表3。

2.5 蘆薈苷對大鼠腎組織中Nephrin、Podocin 蛋白水平的影響

與正常組相比, 模型組腎組織中Nephrin、Podocin 蛋白水平降低(P<0.05);與模型組相比,陽性對照組、(中、高) 劑量實驗組腎組織中Nephrin、Podocin 蛋白水平升高(P<0.05)。 見圖2。

2.6 蘆薈苷對大鼠腎組織中NOX4、p38 MAPK、phospho-p38 MAPK 蛋白水平的影響

與正常組相比, 模型組腎組織中 NOX4、phospho-p38 MAPK 蛋白水平升高(P<0.05);與模型組相比, 高劑量腎組織中NOX4、 phospho-p38 MAPK 蛋白水平,陽性對照組、(低、中)劑量實驗組腎組織中NOX4 蛋白水平降低(P<0.05)。 見圖3。

3 討論

DN 屬一種糖尿病的慢性并發(fā)癥,具有較高致殘率,中國糖尿病患者達11.6%,20% ～25% 出現(xiàn)DN,最終發(fā)展成終末期腎病,導(dǎo)致腎功能出現(xiàn)不可逆損傷[6],發(fā)病機制復(fù)雜,受多因素影響。 本研究發(fā)現(xiàn)模型組較正常組空腹血糖水平升高,腎小球肥大,系膜增厚和腎小球基底膜增厚,間質(zhì)炎癥浸潤,提示DN 可誘導(dǎo)腎器官出現(xiàn)組織病變,出現(xiàn)炎癥從而加重DN。 蘆薈苷是單子葉百合科植物提取物,主要成分為蒽醌類化合物,對腎病大鼠具有促進作用,可對STZ 誘導(dǎo)的DN 大鼠起緩解作用,可降低血清肌酐、血尿素氮、尿蛋白水平,但具體機制尚不明確[7-8]。 本研究發(fā)現(xiàn)蘆薈苷可緩解DN 引發(fā)的腎組織損傷、足細胞損傷、炎癥反應(yīng),降低血糖水平,并且隨著劑量的增加,緩解作用逐漸增強。

表1 6 組大鼠給藥前、給藥后空腹血糖水平比較(± s, n= 8)Table 1 Comparison of fasting blood glucose levels before and after administration in 6 groups of rats

表1 6 組大鼠給藥前、給藥后空腹血糖水平比較(± s, n= 8)Table 1 Comparison of fasting blood glucose levels before and after administration in 6 groups of rats

注:與正常組相比,?P<0.05;與模型組相比,#P<0.05;與給藥前相比,△P<0.05。Note.Compared with the normal group, ?P<0.05.Compared with the model group, #P<0.05.Compared with before administration, △P<0.05.

組別Groups給藥前(mmol/ L)Before administration給藥后(mmol/ L)After administration正常組Normal Group 8.47±1.26 8.68±1.35模型組Model Group 26.88±3.82? 27.15±4.05?陽性對照組Positive control group 27.56±3.14? 12.65±2.51#△低劑量實驗組Low dose experimental group 28.12±3.86? 14.81±2.37#△中劑量實驗組Medium dose experimental group 27.95±3.58? 10.36±1.68#△高劑量實驗組High dose experimental group 28.36±4.06? 8.94±1.59#△F 21.326 65.517 P 0.000 0.000

表2 6 組大鼠血清中IL-1β、TNF-α 水平比較(± s, n= 8)Table 2 Comparison of IL-1β and TNF-α levels in serum of 6 groups of rats

表2 6 組大鼠血清中IL-1β、TNF-α 水平比較(± s, n= 8)Table 2 Comparison of IL-1β and TNF-α levels in serum of 6 groups of rats

注:與正常組比,?P<0.05;與模型組相比,#P<0.05。Note.Compared with the normal group, ?P<0.05.Compared with the model group, #P<0.05.

組別Groups IL-1β(ng/ L) TNF-α(ng/ L)正常組Normal Group 3.15±0.41 4.88±0.53模型組Model Group 10.15±1.25? 12.25±2.15?陽性對照組Positive control group 4.21±0.53# 6.52±0.77#低劑量實驗組Low dose experimental group 8.37±0.45# 8.42±0.95#中劑量實驗組Medium dose experimental group 6.15±0.72# 6.18±0.52#高劑量實驗組High dose experimental group 3.94±0.44# 4.48±0.56#F 126.093 56.694 P 0.000 0.000

圖1 6 組大鼠腎組織形態(tài)變化Note.Black arrow a, Lumen of glomerular epithelial cells ( podocytes).Black arrow b, Lumen of renal tubular epithelial cells.G, Renal tubule.P, Proximal curved tubule.D, Distal curved tubule.Figure 1 Morphological changes of kidney tissue in 6 groups of rats

表3 6 組大鼠腎組織中SOD、MDA、ROS 水平比較(± s, n= 8)Table 3 Comparison of SOD, MDA, and ROS levels in kidney tissue of 6 groups

表3 6 組大鼠腎組織中SOD、MDA、ROS 水平比較(± s, n= 8)Table 3 Comparison of SOD, MDA, and ROS levels in kidney tissue of 6 groups

注:與正常組相比,?P<0.05;與模型組相比,#P<0.05。Note.Compared with the normal group, ?P<0.05.Compared with the model group, #P<0.05.

組別Groups SOD(U/ mL) MDA(μmol/ L) SOD/ MDA ROS(ng/ L)正常組Normal Group 23.15±3.57 38.75±5.56 0.61±0.18 360.15±46.82模型組Model Group 6.90±0.75? 125.82±24.33? 0.05±0.01? 475.66±54.86?陽性對照組Positive control group 20.55±3.14# 46.15±7.32# 0.45±0.09# 400.68±53.15#低劑量實驗組Low dose experimental group 14.52±2.32# 100.56±14.37# 0.14±0.03 425.61±43.15中劑量實驗組Medium dose experimental group 16.33±2.14# 65.17±8.14# 0.26±0.06# 395.56±40.23#高劑量實驗組High dose experimental group 20.38±2.62# 45.38±5.91# 0.45±0.08# 386.18±38.16#F 40.916 60.715 42.228 5.820 P 0.000 0.000 0.000 0.000

圖2 6 組腎組織中Nephrin、Podocin 蛋白水平Note.A, Normal Group.B, Model Group.C, Positive control group.D, Low dose experimental group.E, Medium dose experimental group.F,High dose experimental group.Compared with the normal group, ?P<0.05.Compared with the model group, #P<0.05.Figure 2 Nephrin and Podocin protein levels in 6 groups of kidney tissue

圖3 6 組腎組織中NOX4、p38 MAPK、phospho-p38 MAPK 蛋白水平Note.A, Normal Group.B, Model Group.C, Positive control group.D, Low dose experimental group.E, Medium dose experimental group.F, High dose experimental group.Compared with the normal group, ?P<0.05.Compared with the model group, #P<0.05.Figure 3 NOX4、p38 MAPK、phospho-p38 MAPK protein levels in 6 groups of kidney tissue

IL-1β、TNF-α 作為炎癥因子,在DN 中研究廣泛,DN 中糖代謝紊亂均可介導(dǎo)炎癥細胞浸潤促進IL-1β、TNF-α 表達,進一步誘導(dǎo)炎癥細胞浸潤,形成炎癥循環(huán),減緩炎癥現(xiàn)象可緩解疾病[9-10]。 本研究發(fā)現(xiàn),與正常組相比,模型組炎癥因子IL-1β、TNF-α水平升高,機體炎癥反應(yīng)加劇,進一步誘導(dǎo)炎癥細胞浸潤,形成炎癥循環(huán)加重疾病。 經(jīng)蘆薈苷治療后血清中IL-1β、TNF-α 水平降低,提示蘆薈苷可緩解高糖高脂、STZ 導(dǎo)致的炎癥因子升高現(xiàn)象。

腎小球足細胞裂隙跨膜蛋白Nephrin、Podocin均為足細胞標記基因,其中Nephrin 是第一個被發(fā)現(xiàn)的裂隙跨膜蛋白,特定位于足細胞足突裂孔隔膜處,腎小管病變時數(shù)量減少誘導(dǎo)裂孔隔膜結(jié)構(gòu)變化影響腎功能[11];Podocin 對于維持足細胞裂隙隔膜結(jié)構(gòu)的完整性中相關(guān)蛋白復(fù)合體的結(jié)構(gòu)和功能正常發(fā)揮起重要作用[12]。 抑制Nephrin、Podocin 表達可加重DN[13]。 本研究發(fā)現(xiàn)模型組較正常組腎組織中Nephrin、Podocin 蛋白水平降低,與模型組相比,(中、高)劑量實驗組腎組織中Nephrin、Podocin 蛋白水平升高,提示DN 大鼠腎組織中Nephrin、Podocin蛋白水平降低可能改變破壞足細胞裂隙隔膜結(jié)構(gòu),腎功能受到影響。 蘆薈苷可減緩DN 誘導(dǎo)的Nephrin、Podocin 蛋白水平降低現(xiàn)象, 升高二者水平,從而保持足細胞裂隙跨膜蛋白的完整性,減輕腎功能損傷。

炎癥反應(yīng)誘發(fā)氧化應(yīng)激,氧化應(yīng)激是DN 發(fā)生的重要原因。 SOD 作為抗氧化系統(tǒng)重要一員,可清除氧自由基,其水平反映機體抗氧化能力;MDA 是ROS 與其他物質(zhì)發(fā)生氧化反應(yīng)時脂質(zhì)過氧化物分解產(chǎn)物[14]。 SOD/ MDA 反映機體抗氧化應(yīng)激程度。NOX 是催化生成ROS 的關(guān)鍵酶,腎組織中表達較高,存在于細胞核、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中[15];糖尿病狀態(tài)下NOX4 水平升高可誘導(dǎo)ROS 生成,減少NOX4水平可降低ROS 產(chǎn)生,抑制高糖誘導(dǎo)的成纖維細胞增殖和活化,從而抵抗糖尿病腎纖維化[16],正常情況下p38 MAPK 在腎組織中表達較少,ROS 刺激下,MAPK 激酶被激活,作用于p38 MAPK 殘基,殘基發(fā)生磷酸化后,p38 MAPK 發(fā)生活化,活化后的p38 MAPK 參與細胞生長、 分化及炎癥、 氧化應(yīng)激過程[17]。 足細胞損傷中p38 MAPK 發(fā)揮重要作用[18],抑制p38 MAPK 信號通路可減少巨噬細胞浸潤和TNF-α、IL-6 表達,減輕腎組織炎癥損傷[19]。抑制NOX4 活性可抑制ROS 活化,進而阻斷p38 MAPK 磷酸化[20-21]。 本研究發(fā)現(xiàn)與正常組相比,模型組腎組織中NOX4、phospho-p38 MAPK 蛋白、ROS水平升高,SOD/ MDA 降低;DN 中可激活NOX4 水平,從而誘導(dǎo)ROS 產(chǎn)生,使p38 MAPK 激活,從而加速細胞浸潤和炎癥因子IL-1β、TNF-α 表達,促進腎組織、足細胞病變,加重炎癥反應(yīng),加重疾病進程。與模型組相比, 高劑量實驗組腎組織中NOX4、phospho-p38 MAPK 蛋白、ROS 水平降低,SOD/ MDA升高,提示蘆薈苷可抑制NOX4 / ROS / p38 MAPK 信號通路,從而促進機體抗氧化作用,抑制細胞浸潤和炎癥反應(yīng),實現(xiàn)對DN 大鼠腎組織及足細胞的保護。

綜上所述,蘆薈苷可能通過抑制NOX4 / ROS /p38 MAPK 信號通路發(fā)揮抗炎和實現(xiàn)對足細胞的保護。 但蘆薈苷成分復(fù)雜,亦可能通過別的通路實現(xiàn)對炎癥、足細胞作用,且p38 MAPK 與足細胞裂隙跨膜蛋白的作用尚不明確,需進一步探討。