體外培養GFP 裸小鼠顱骨細胞的表形分析

閆 可,吳從嚴,戴純剛,趙海峰,王為華,趙耀東?,朱文昱?,黃 強

(1.南京醫科大學附屬蘇州科技城醫院 神經外科,江蘇 蘇州 215153;2.南京醫科大學上海市第一人民醫院 神經外科,上海 200080;3.南京醫科大學附屬蘇州科技城醫院 病理科,江蘇 蘇州 215153;4.蘇州大學附屬第二醫院 神經外科,江蘇 蘇州 215004)

轉綠色熒光蛋白( green fluorescent protein,GFP)基因的近交系裸小鼠(GFP 裸小鼠)是由蘇州大學黃強課題組研發的[1],已在腦膠質瘤移植實驗中發現, GFP 裸小鼠的腦組織和細胞因高表達GFP, 在示蹤宿主源性腫瘤微環境( Tumor microenvironment,TME) 方面,不需要加熒光示蹤劑而能直接起到清楚的示蹤作用[2-7],能很好地證明TME 中的巨噬細胞,樹突狀細胞,少突膠質細胞和血管內皮等細胞,在變成腫瘤相關細胞的過程中,通過細胞融合而惡變,重構成更加異質的TME;但在我們正在進行的顱骨成形研究的GFP 裸小鼠骨細胞中,是否也能在示蹤新骨形成方面起重要作用仍是未知。 本文提出這個問題,是由于發現GFP 新生裸小鼠的顱骨細胞,在短期培養中,見到成骨前體細胞有強大的擴增和分化能力,除了能在熒光顯微鏡下定性GFP 的局部位置和熒光強弱,還能在拉曼/ 多光子顯微鏡下進行量化,有望為下一步用于顱骨成形研究中對成骨和破骨細胞進行甄別和調控。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

出生后3 d 的GFP 裸小鼠( Foxn1nu.B6-CAGEGFP / SU,SPF 級)6 只,無關性別,體重約3 g,購自并飼養在蘇州大學實驗動物中心[SCXK(蘇)2018-0006][ SYXK(蘇)2017-0043],本實驗經蘇州科技城醫院醫學倫理委員會批準(IRB2018019),并嚴格遵循 “3R” 原則給與人道關懷。

1.2 主要試劑與儀器

細胞培養箱(MCO-18AC,Sanyo 日本);倒置顯微鏡( CKX41, Olympus 日本), 熒光顯微鏡( DM2500, Leica 德國); BMP-6 抗體( AB15640,abcam);CD11c 抗體(AF1396,碧云天);CD68 抗體( GK600710, 基因科技); CD206 抗體( 141711,BioLegend);DAB 試劑盒( GK347010,基因科技);RPIM1640 培養基( AE26543277,HyClone);離心機( TDZ5-WS, BIORIDGE ); RPIM1640 培養基(AE26543277,HyClone);胎牛血清(1616756,BI);青/ 鏈霉素(15140163,gibco);細胞培養板(corning,60 mm);12 孔細胞培養板(corning);15 mL 離心管(corning);移液槍(Thermo);超凈臺(蘇州凈化)。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養方法

參照陳潔等[8]的方法,加以改良,簡要過程如下:(1)乳鼠脫頸處死,75%乙醇消毒全身,置于超凈臺上,剪開頸背及頭頂皮膚,取雙側頂骨,保留骨膜,放入含有青/ 鏈霉素的PBS 溶液中,剪成1 mm2大小的骨片,直接接種于含有10%胎牛血清及青/鏈霉素的RPMI1640 培養基中,在5% CO2培養箱中培養;(2) 待細胞移行出骨片貼培養皿壁生長后用消毒鑷子夾出骨片,繼續培養到布滿皿壁90%時,用0.25% 胰酶消化3 min,得到原代培養細胞P0;(3)P0 按1 ∶1傳代,每3 d 換液1 次,待細胞長滿90%時,收獲到的細胞為P1;(4)P2 參照P1 培養和收集。 P0,P1 和P2 均在液氮中保存備用。

1.3.2 細胞免疫化學染色

被檢細胞放入加有圓形載玻片的12 孔板內,待細胞爬滿玻片后,用PBS 潤洗3 次,4%多聚甲醛溶液室溫固定20 min,后續簡要過程如下:(1) 0.5%TritonX-100 室溫通透20 min,PBS 清洗三次。 (2)3%過氧化氫溶液清除內源性過氧化物酶,室溫15 min,PBS 清洗。 (3)10%山羊血清室溫封閉30 min。(4)吸出血清,孵一抗,4℃過夜。 (抗體工作濃度:BMP-6,1 ∶200;CD11C,1 ∶150;CD68,1 ∶100;CD206,1 ∶100)(5)PBS 沖洗3 次,室溫孵二抗30 min,后用PBS 沖洗。 (6) DAB 光鏡下顯色2 ～5 min, 棄去DAB,PBS 沖洗數次。 (7) 蘇木精染核15 s,自來水沖洗玻片。 (8)無水乙醇脫水3 min 共3 次,中性樹膠封片。

2 結果

2.1 P0～P2 細胞和離體骨瓣狀態

游離骨片置于培養皿底7 d,在骨片中央和邊緣能見到細胞陸續移行出來,沿皿壁生長,隨著培養時間延長,細胞數量不斷增多,排裂緊,在低倍鏡下呈鵝卵石樣,在高倍鏡下以長纖維和星形為主,白光和熒光鏡下所見到的形態基本一致。 到6 ～8 d細胞布滿皿底的90%時收獲(P0),接著又繼續傳了二代(P1 和P2),傳代時間分別為8 d 和15 d,如果再往下傳,細胞生長趨勢是越來越慢,因此結束細胞傳代實驗,并把收獲的細胞于液氮凍存。

從細胞形態看,隨著傳代次數增多,向終末分化細胞增加,甚至老化會加重。 如果將取出的骨片繼續培養(骨片傳代),仍可見到細胞從骨片邊緣移行出來繼續生長,說明培養液中存放的離體骨片本身也是活著的,也可傳代,但這屬于類器官培養,難度更大,有待今后研究。 詳見圖1。

2.2 標志蛋白表達

(1)骨形態發生蛋白(BMP-6)的免疫復合物為棕色,在鏡下見陽性細胞散在分布于細胞群各處,所占比例不高(圖2A 紅箭頭),但表形很有特征性,免疫復合物主要在細胞質,組成細胞骨架(圖2A 黃箭頭),也有些沉積于染色質(圖2A 綠箭頭)。 更具特征性的是在胞外也有沉積,跨越多個細胞核,容易誤判在多核細胞中表達(圖2A 藍箭頭);

(2)巨噬細胞甘露糖受體1(CD206) 的深棕色免疫復合物也只存在于細胞群中的少數細胞中,特征是只在細胞漿表達,復合物呈顆粒狀(圖2B);

(3)CD68 的表達與CD206 相似,但CD11c 未見表達(圖2C 和圖2D)。

3 討論

3.1 對正常成骨細胞系的評價

這是指已具永生化潛能的細胞,就顱骨而言:有Kodama 等[9]和Sudo 等[10]分別于1981 和1983年報告了新生小鼠顱骨細胞體外連續傳代培養至數十代,以堿性磷酸酶陽性表達,礦化細胞聚集,形成骨的雛形為建系標準; 其中Sudo 等[10]建立的MC3T3 細胞系至今已成為商品被廣泛應用。 可是1997 年Nakayama 等[11]從p53 缺陷小鼠的顱骨中建立MMC2 細胞系時指出,在他之前的細胞系幾乎都是反復傳代,獲得永生化基礎上建立的,這種永生化與未檢測的相關基因突變有關。 他報告的MMC2成骨細胞系的染色體已是異倍體,所幸小鼠致瘤試驗陰性,他的結論是MMC2 的永生化,除了與p53缺陷相關,不排除還有其它異常基因參與。 2004年,Kadowaki 等[12]從新生的GFP 轉基因小鼠的顱骨中分離出成骨細胞,連續傳26 代后建立了自發綠色熒光的C3 細胞系,再通過腺病毒轉染BMP-2 于C3 細胞,用于4 mm 直徑圓形缺損顱骨的修補,在熒光鏡下明確顯示,荷BMP-2 的GFP+細胞是形成新骨的主體。 同樣,除了通過熒光示蹤更加直接證明C3 細胞的成骨作用,但C3 基因型是否有改變不得而知。 總之,永生化細胞系如果作為治療的工具細胞,用于改善顱骨成形術的預后,應注意致癌事件的發生。

3.2 對短期培養的成骨細胞評價

這里指來自生長發育中的新生小鼠顱骨細胞,培養早期的擴增能力不亞于成骨細胞系,不存在致瘤性,用于細胞接種時,根據所處的環境可向不同方向分化,評價其優劣的標準是看這個群體中的前體細胞占有率和亞群細胞的類型。 從本文報告的結果來看(圖2),至少有與骨再生高度相關的成骨前體細胞和巨噬細胞(macrophages,M) 兩種亞群細胞標志蛋白陽性,不妨探討一下潛在的研究價值。已知骨再生有膜內成骨和軟骨內成骨,前者見于骨折間隙小的扁平骨,后者見于間隙大的長骨[13],無論那種,M 都必須參與修復[14-16]。 在修復初期,M的作用是吞噬骨折部位的壞死組織和細胞碎片,后期募集間充質干細胞和血管祖細胞[17],這種功能轉變稱 “極化”,炎癥性M 又稱為經典活化巨噬細胞(M1);在再生中激活的M 稱選擇性激活巨噬細胞(M2),M1 / M2 的出生地均在骨髓(M0),根據骨折當時建立穩態環境需要決定對M0 是否進行征集。本文檢測到的CD68+細胞可定性為M1 細胞[18],同樣CD206+細胞可定性為M2 細胞[19],結合還檢測到的BMP-6+細胞可定性為成骨前體細胞[20]。 有鑒于此,本文的P0,P1 和P2 有望作為工具細胞用于骨缺損修復實驗。 不得不指出的是, 代表M0 的CD11c+細胞[21]未被檢測到,究其原因可能與骨片離體培養,脫離了機體的骨髓環境有關。

圖1 新生小鼠顱骨細胞培養Note.A (naked eye), Mice skull fragments for osteocyte culture.B (inverted microscope), The white area around the bone plate showed that the bone cells began to proliferate.As the culture time increased, the proliferation area gradually expanded and extended from the bone plate to the bottom of the dish.C ( inverted microscope), Amplification of red B-frame was the bone cells cultured for 2 days.P0 ～P2 ( inverted microscope) is a continuous passage cell, P0 ( Zero generation), P1 ( First generation ), P2 ( Second generation ) They have good proliferators, and their cells are like pebble-like; The morphology of D, E and F cells under different multiples of fluorescence in the same field of vision.E and G were compared under the same multiple fluorescence to daylight.The two forms were basically the same, except that the cytoplasm of e showed more clearly, and in the case of further magnification, F could clearly show pseudo-foot and pseudo-filament.Figure 1 Culture of skull cells in newborn mice