羅非魚魚皮膠原蛋白酶法提取工藝及特性研究

王 晴，錢玉梅，李紅俠，陳紅玲

(1.宿州學院，安徽 宿州 234000； 2. 宿州市天然產物與功能性食品工程技術研究中心，安徽 宿州 234000)

0 引言

近些年來，我國漁業發展迅速，已躋身于全球第一漁業大國，在加工生產過程中不可避免地產生魚皮、魚鱗、魚鰾等廢棄物，這些廢棄物的充分利用可以提高漁業加工的附加價值，增加經濟效益，反過來促進漁業的發展[1-2]。經研究表明魚皮中含有豐富的膠原蛋白，膠原蛋白是一種白色不透明無支鏈的纖維狀蛋白質，廣泛應用于醫藥、化妝品和食品工業中，例如功能食品、食品添加劑、食品包裝材料等[3]，因此以水產加工廢棄物魚皮為原料制備膠原蛋白具有廣闊的開發前景。以羅非魚魚皮為材料，采用胃蛋白酶法提取，利用單因素和正交試驗優化胃蛋白酶酶法提取的最優條件，并對胃蛋白酶法提取的膠原蛋白的溶解性能和保水性能進行研究，為水產膠原蛋白的進一步應用提供依據，以期提高漁業的附加價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羅非魚魚皮(廣東湛江水產有限公司)、胃蛋白酶、無水乙醇、氯化鈉、硫酸銅、氫氧化鈉、硫酸、氯胺T、乙酸等均為分析純(國藥集團化學試劑有限公司)等。

1.2 儀器與設備

SP-723分光光度計(上海光譜儀器有限公司)、GL-23M高速離心機(湖南湘儀集團)等。

1.3 試驗方法

1.3.1 羅非魚魚皮的預處理

將去鱗魚皮剪碎(約3 × 3 mm)，用 0.1 M NaOH溶液浸泡24 h，以去除脂肪和部分雜蛋白，然后洗至中性，再用正己烷浸泡脫脂24 h，真空冷凍干燥后，粉碎(10目)[4]。

1.3.2 胃蛋白酶法提取魚皮膠原蛋白單因素試驗

將粉碎后的魚皮置于含有胃蛋白酶(200 U/mg)的預冷0.5 M乙酸溶液中，調節pH，并于水浴鍋中在一定溫度下連續攪拌提取一定時間，取上清，緩慢加入NaCl至最終濃度0.9 M，鹽析過夜，然后2 500 g離心30 min，棄上清，將沉淀溶解于含1.0 M NaCl的Tris-HCl緩沖液中，再次于20 000 g離心1 h，取上清透析脫鹽48 h得到膠原蛋白提取液[5]。

1.3.3膠原蛋白提取率測定

羥脯氨酸含量按GB/T 9695.23-2008測定，膠原蛋白提取率含量按下式計算[4]：

其中，X——膠原蛋白提取率，%；c——羥脯氨酸含量；11.1——換算系數.

1.3.4正交試驗

以單因素結果為依據建立因素水平表(表1)，以膠原蛋白提取率為評判指標，按照L9(34)正交表來進行試驗優化方案的設計。

表1 正交試驗因素水平設計表

1.3.5 溶解性測定

酶解提取的膠原蛋白冷凍干燥，取一定質量溶于0.5 mol/L醋酸中，使得濃度為5 mg/mL。取5 mL分別調至pH為2、3、4、5、6、7、8、9，保持pH值不變，蒸餾水定容至10 mL， 4000 r/min離心15 min，，雙縮脲法測定上清液蛋白質含量，并同時將樣品溶于0.5 mol/L醋酸溶液，采用雙縮脲法測定樣品總蛋白含量，用公式(1)計算溶解性[6]。

(1)

1.3.6 保水性測定

量取50 mL蒸餾水，加入凍干后的膠原蛋白 0.05 g，攪拌，置于1000 r/min條件下離心5 min，棄分離水，稱量殘留物質量，并置于25℃干燥箱中，每隔20 min測一次質量，按公式(2)計算水分殘存率[6]，以測定其保水性強弱。

(2)

式中：Y表示水分殘存率%；m0表示離心剩余物質量/g；m表示每隔一段時間剩余物質量/g。

2結果與討論

2.1 單因素試驗結果

2.1.1提取時間對膠原蛋白提取率的影響

設置酶解溫度40℃，料液比1:70，pH 3，酶解時間分別為5、10、15、20、25 h時，膠原蛋白的提取率如圖1所示，當提取時間較短時，膠原蛋白尚未被完全酶解，故隨著時間的延長，膠原蛋白與酶能夠充分結合，反應速率加快，膠原蛋白的酶解量不斷增大，膠原蛋白提取率也不斷增加，但當膠原蛋白提取率上升到某一極限值后，再延長提取時間則對膠原蛋白提取率影響較小[7]。因此，從使膠原蛋白充分被酶解且節省時間的角度考慮，最適宜提取時間選取15 h。

圖1 提取時間對膠原蛋白提取率的影響 圖2 提取溫度對膠原蛋白提取率的影響

2.1.2提取溫度對膠原蛋白提取率的影響

設置酶解時間15 h，料液比1:70，pH 3，酶解溫度分別為40、45、50、55、60、65℃時，膠原蛋白的提取率如圖2所示，在35～50 ℃時，膠原蛋白提取率隨溫度的上升持續增加，但當溫度超過50 ℃，膠原蛋白提取率出現下降，因為溫度過高，不利于胃蛋白酶活性的發揮，致使其酶解作用減弱[8]。因此，最適提取溫度選用50 ℃。

2.1.3料液比對膠原蛋白提取率的影響

設置酶解時間15 h，酶解溫度50 ℃，pH 3，料液比分別為1:40、1:50、1:60、1:70、1:80、1:90 g/mL時，膠原蛋白的提取率如圖3所示，料液比位于1:40至1:70之間，膠原蛋白提取率不斷上升，料液比為1:80時，膠原蛋白提取率開始下降，可能由于當液料比低于1:70時，膠原蛋白酶解時溶劑不充足，當料液比大于1:70時，溶劑開始過量，此時酶解液稀釋，膠原蛋白提取率反而降低[9]，因此料液比選為1:70。

2.1.4 pH對膠原蛋白提取率的影響

設置酶解時間15 h，酶解溫度50 ℃，料液比1:70，pH分別為1、2、3、4、5、6時，膠原蛋白的提取率如圖4所示，pH小于3時，膠原蛋白提取率隨酸性減少而增加，當pH值增加到3時，膠原蛋白提取率最大，隨后便隨著酸性減少而減低。且酸性越低降低越迅速，表明pH值過低或過高均會對胃蛋白酶的活性有所抑制，可能通過影響胃蛋白酶分子的構象、解離狀態及膠原蛋白的解離狀態，進而影響胃蛋白酶活力和酶解反應速率，另一方面，較高的pH可能引入更多的雜質離子，污染反應環境[10]。所以，胃蛋白酶提取膠原蛋白的最適pH為3。

圖3 料液比對膠原蛋白提取率的影響 圖4 pH對膠原蛋白提取率的影響

2.2 正交試驗結果

如表2所示，四個因素主次順序為A>B>C>D，最優條件組合為A2B2C1D1，即最佳的提取條件為酶解時間15 h、酶解溫度50 ℃、料液比1:60、pH為2。按照最優條件進行驗證試驗，測得膠原蛋白提取率為90.3%，高于表2中各組合的膠原蛋白提取率，說明了該方法可靠定，因此可用于優化胃蛋白酶酶解提取膠原蛋白的最佳提取工藝條件。

表2 正交試驗結果

2.3 酶法提取膠原蛋白特性分析

2.3.1羅非魚魚皮膠原蛋白溶解性能

從圖5可以看出，隨著pH值的上升，羅非魚魚皮膠原蛋白的溶解度呈現持續下降趨勢，在酸性條件下溶解性能大于堿性，且酸性越高，溶解性能越好，pH在3以下，膠原蛋白溶解度達70%以上，當pH超過3，溶解性能開始迅速下降，中性條件下，溶解性能僅為25%左右。膠原蛋白溶解性隨 pH 的變化跟其等電點位置有關，當處于等電點，兩性離子達到電荷平衡，溶解度達到最低，因此結果表明羅非魚魚皮膠原蛋白等電點位于7 附近。

圖5 羅非魚魚皮膠原蛋白溶解性能 圖6 羅非魚魚皮膠原蛋白保水性能

2.3.2羅非魚魚皮膠原蛋白保水性能

由圖6可以看出，胃蛋白酶法提取的羅非魚魚皮膠原蛋白水分殘存率隨時間增加現迅速后緩慢降低，但在360 min后仍保持在90%以上，可見其保水性能較好，可能由于胃蛋白酶酶切位點使得膠原蛋白暴露了較多的親水基團。

3 結論

研究了酶解時間、酶解溫度、料液比、pH對胃蛋白酶提取羅非魚魚皮膠原蛋白提取率的影響，得到最佳酶解條件：酶解時間15 h、酶解溫度50 ℃、料液比1:60、pH為2時，膠原蛋白提取率高達90.3%，該法提取的膠原蛋白溶解性能及保水性能較好，本研究為漁業資源的有效利用及膠原蛋白的進一步開發利用提供了理論依據。