和厚樸酚對過氧化氫誘導的人神經母細胞瘤細胞損傷的保護作用及機制研究

錢保進，王 玉

內質網(endoplasmic reticulum，ER)在真核細胞胞質內廣泛分布，是細胞內合成蛋白質并進行折疊、寡聚化加工的重要場所，可維持內環境穩定；同時內質網在脂類代謝中起著核心作用。內質網在受到高糖、高脂等多種因素刺激時，生理功能發生紊亂，稱為內質網應激(endoplasmic reticulum stress, ERS)；持續的ERS可能通過激活凋亡途徑造成神經元細胞的損傷和凋亡。目前在多種神經退行性疾病中發現了ERS導致神經元細胞凋亡的現象，比如帕金森病(Parkinsons disease, PD)[1]。研究[2-4]表明PD主要的病理改變為多巴胺神經元變性死亡以及由應激誘發的神經元凋亡。其患者黑質內的神經細胞凋亡被過度激活[5]。PD的發生發展與神經細胞ERS相關的凋亡有密切聯系[1,6]。和厚樸酚(honokiol, HNK)是傳統中藥厚樸中分離出的有效成分之一，是一種含有酚羥基的活性物質, 具有一定的心腦血管保護功效[7-8]。此外，研究[9-10]表明HNK具有抑制氧化應激和神經炎癥等的神經保護作用。但HNK對神經細胞的ERS相關的凋亡作用目前尚不清楚。該實驗用過氧化氫(H2O2)處理人來源神經母細胞瘤細胞(SH-SY5Y)構建細胞損傷模型，探討HNK對神經元細胞ERS損傷的保護作用及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料人神經母細胞瘤細胞(SH-SY5Y)SCSP-5014購于中科院上海細胞庫；HNK購于成都德銳可生物科技有限公司；DMEM培養液和胎牛血清購于美國Hyclone公司；PBS購于美國GIBCO公司；胰蛋白酶、CCK-8、流式試劑盒購于美國Sigma公司；Bcl-2、Bax抗體購于美國CST公司；Caspase-3、β-actin、BIP、CHOP、Caspase-12抗體、羊抗兔IgG二抗辣根過氧化物酶(HRP)標記購于上海中杉金橋生物技術有限公司。

1.2 細胞培養SH-SY5Y細胞用含有10%胎牛血清的DMEM培養基在37 ℃、5% CO2恒溫培養箱中進行培養，使其貼壁生長，每日更換培養基1次。通過倒置顯微鏡觀察，當細胞覆蓋到培養瓶85%左右時用胰酶消化進行傳代。

1.3 實驗分組實驗分為4組。① 保護組：先加入10 μmol/L HNK于DMEM培養液孵育6 h，再加入H2O2；② 溶劑組：培養液加入與保護組HNK等體積的DMSO；③ 對照組：只添加培養液；④ 損傷組：培養液加入終濃度為400 μmol/L的H2O2。

1.4 建立模型當SH-SY5Y細胞處于對數生長期時，以3×104個/ml的密度接種于96孔板中，每孔100 μl，孵育12 h后，再加入梯度濃度的H2O2(0、50、100、200、400、800 μmol/L)孵育24 h，每孔加入10 μl CCK-8，37 ℃孵育1 h，通過酶標儀于450 nm波長下，測量每孔吸光度值。用對照組的百分比來表示細胞活性從而篩選出H2O2的終濃度。

1.5 CCK-8比色法篩選HNK濃度當SH-SY5Y細胞處于對數生長期時，稀釋到3×104個/ml的密度后接種于96孔板中，每孔100 μl，孵育12 h后，對照組和損傷組中加入的培養液含10%胎牛血清；HNK組和溶劑組分別加入不同濃度(0、1、5、10、20、50 μmol/L)HNK及等體積DMSO孵育6 h。孵育結束吸取掉上清液，對照組再加入DMEM培養液，損傷組和不同濃度的HNK組加400 μmol/L的H2O2，37 ℃條件下孵育24 h，然后每孔加入10 μl CCK-8，最終篩選出HNK的適宜濃度。

1.6 免疫熒光染色觀察SH-SY5Y細胞凋亡細胞用6孔板接種，每組按分組要求給予不同處理后，吸出上清液，經清洗、4%多聚甲醛固定、0.1% Triton X-100通透、3% H2O2滅活內源性過氧化物后滴加5% BSA于37 ℃封閉30 min。清洗后滴加合適濃度的一抗，接著在濕盒中4 ℃條件下孵育過夜，再用PBS清洗。加入熒光二抗37 ℃孵育1 h，PBS清洗3次，每次間隔5 min。加入DAPI進行細胞核染色，室溫避光條件下孵育10 min后用PBS清洗3次，每次間隔5 min。接著滴加抗熒光淬滅劑后封片，并迅速用熒光顯微鏡下觀察。

1.7 流式細胞儀檢測SH-SY5Y細胞凋亡細胞用6孔板接種，每組按分組要求給予不同處理后，消化細胞，制成單細胞懸液，收集細胞于流式管內，再用預冷PBS洗3次。在EP管中將細胞重懸浮于200 μl結合緩沖液里，每管常規加入10 μl熒光素FITC標記的膜聯蛋白V(AnnexinV-FITC)和 5 μl碘化丙啶(PI)進行染色，混勻后避光室溫孵育15 min，再加入300 μl結合緩沖液后立即檢測。根據AnnexinV-FITC及PI的熒光強度，流式細胞儀檢測細胞凋亡率(%)，同樣操作重復3次。

1.8 Western blot檢測凋亡和內質網應激相關蛋白表達收集各實驗組處理的細胞，PBS清洗1次后加入適當細胞裂解液。常規提取細胞蛋白，再用BCA法對蛋白含量進行定量測定。取20 μg蛋白樣品進行聚丙烯酰胺凝膠電泳；再通過濕轉法將蛋白條帶印跡到PVDF膜上；用5%脫脂奶粉封閉1 h；再分別用特異的細胞抗體(Bcl-2、Bax、Caspase-3、BIP、CHOP、Caspase-12、內參GAPDH)孵育，在4 ℃冰箱中過夜；隔天洗膜15 min×3次；相應的二抗在室溫條件下孵育1 h；洗膜8 min×3次；顯色。

2 結果

2.1 不同濃度H2O2對SH-SY5Y細胞活性的影響不同H2O2濃度(0、50、100、200、400、800 μmol/L)作用于SH-SY5Y細胞后，細胞活性分別為(2.64±0.23)、(2.50±0.57)、(2.37±0.35)、(1.97±0.42)、(1.50±0.34)、(1.11±0.23)，各組間差異有統計學意義(F=47.01，P<0.001)，見圖1。可見在一定范圍內，細胞損傷程度逐漸增加，細胞活性明顯下降。當H2O2的濃度為400 μmol/L時，細胞損傷接近50%，因此選取400 μmol/L作為造細胞損傷模型的濃度。

圖1 不同濃度(50、100、200、400、800 μmol/L)H2O2對SH-SY5Y細胞活性的影響

2.2 不同濃度HNK對H2O2誘導的SH-SY5Y細胞活性的影響進一步實驗觀察不同濃度的HNK對SH-SY5Y細胞凋亡的作用，圖2中細胞活性分別為(1.98±0.91)、 (1.23±0.09)、(1.32±0.13)、(1.40±0.10)、(1.56±0.13)、(1.78±0.19)、(1.54±0.17)、(0.91±0.17), 各組間差異有統計學意義(F=28.87，P<0.001)。實驗結果提示，低濃度時，HNK對H2O2誘導的SH-SY5Y細胞凋亡有一定保護作用，在10 μmol/L時保護作用最佳；隨著濃度升高保護作用減弱，達到50 μmol/L時甚至產生損傷作用。因此，選取10 μmol/L作為觀察HNK對SH-SY5Y細胞保護作用的濃度。

2.3 HNK對H2O2誘導的SH-SY5Y細胞凋亡的影響免疫熒光法結果發現，與對照組比較，損傷組經過400 μmol/L H2O2處理SH-SY5Y細胞24 h后，凋亡細胞增多，Caspase-3的熒光較強。與損傷組比較，保護組凋亡細胞減少，Caspase-3的熒光強度減弱(圖3)。此外，溶劑組與損傷組比較，H2O2誘導的SH-SY5Y細胞凋亡情況差異無統計學意義。

在流式細胞檢測儀上AnnexinV-PI雙染色顯示，與對照組比較，損傷組的細胞凋亡率升高，差異有統計學意義(P<0.01)；與損傷組比較，保護組的細胞凋亡率下降，差異有統計學意義(P<0.01)，見圖4。溶劑組與損傷組比較，H2O2誘導的SH-SY5Y細胞凋亡率差異無統計學意義。

2.4 HNK對Bcl-2/Bax比值的影響損傷組較對照組Bcl-2/Bax比值明顯降低(P<0.01)，保護組較損傷組比值增高，差異有統計學意義(P<0.01)，見圖5。溶劑組與損傷組比較，HNK對Bcl-2/Bax比值差異無統計學意義。

2.5 HNK對Caspase-3蛋白表達的影響與對照組相比，損傷組Caspase-3蛋白表達增加，而保護組Caspase-3蛋白表達降低，差異均有統計學意義(P<0.01)，見圖6；與損傷組比較，溶劑組HNK對Caspase-3蛋白表達的影響差異無統計學意義。

2.6 HNK對ERS的影響損傷組BIP、CHOP及Caspase-12表達上調，差異有統計學意義(P<0.01)，提示ERS增加。加入低濃度HNK保護后，ERS相關指標下調，差異有統計學意義(P<0.01)，見圖7。溶劑組與損傷組比較，HNK對BIP、CHOP及Caspase-12蛋白表達的影響差異無統計學意義。

3 討論

ERS過度可以干擾細胞正常功能，或通過ERS 相關的凋亡途徑引起細胞凋亡，導致疾病的發生。研究[1]表明ERS介導的凋亡信號傳導途徑可能與多種中樞退行性疾病如PD 的發病有關。HNK是中藥厚樸中有效活性成分之一，有研究[11]報道HNK具有抗炎、抗腫瘤和抗氧化的作用。但HNK對神經元ERS的作用尚不十分清楚。本研究主要探究HNK對H2O2誘導神經母細胞瘤SH-SY5Y細胞損傷的保護作用及其可能機制。

Caspase-12是起始Caspase，是ERS的特異性凋亡成員，其誘導Caspase-3激活[12-13]。CHOP是ERS 條件下誘導的轉錄因子，可引起細胞周期停滯及DNA 損傷，使細胞發生凋亡，已經被廣泛視為ERS 的凋亡標志[14]。目前認為CHOP 可以通過下調Bcl-2 的表達而促進ERS 誘導的細胞凋亡。因此通過藥物干預后研究Caspase-12和CHOP表達可以初步了解藥物對ERS 的作用。

圖3 免疫熒光觀察SH-SY5Y細胞的Caspase-3表達情況 ×50

圖4 流式細胞術測定SH-SY5Y細胞的凋亡情況

圖5 Bcl-2/Bax比值情況

圖6 Caspase-3蛋白表達情況

圖7 BIP、CHOP及Caspase-12蛋白表達情況

本研究中，與對照組比較，H2O2刺激后造成SH-SY5Y細胞損傷(P<0.01)，導致細胞凋亡，同時Bcl-2/Bax比值顯著降低，Caspase-3蛋白水平增加(P<0.01)，此外BIP、CHOP及Caspase-12蛋白表達升高(P<0.01)，提示H2O2刺激的神經細胞ERS損傷模型成功。溶劑組與損傷組比較，HNK對BIP、CHOP及Caspase-12蛋白表達的影響差異無統計學意義，提示溶劑DMSO不會對研究造成影響。與損傷組比較，10 μmol/L HNK保護組凋亡細胞減少，Caspase-3的熒光強度減弱，同時蛋白表達結果也驗證了這一結論，提示HNK可以抑制H2O2誘導的SH-SY5Y細胞凋亡。此外，HNK能明顯下調BIP、CHOP及Caspase-12蛋白表達，減少SH-SY5Y細胞的凋亡，說明HNK能夠抑制H2O2誘導的SH-SY5Y細胞ERS相關的凋亡。

綜上，HNK可以在H2O2誘導的神經細胞損傷中發揮保護作用，其機制可能與抑制ERS相關的細胞凋亡有關，因此HNK可能對ERS導致的神經損傷性疾病如PD的防治具有潛在的改善和保護作用。