一株野生古巴栓孔菌的鑒定及系統發育分析

史維麗 班立桐 黃亮 楊紅澎 王玉 孫寧 李奕葶

摘 ? ?要：以福建省廈門市廈門植物園中采集的一株野生真菌為研究對象，觀測其子實體的形態特征以及菌絲的生長情況，并對其進行了分子鑒定。在GenBank數據庫中進行Blast比對ITS序列后，采用NJ（Neighbor-Joining）鄰接法構建出系統發育樹，鑒定出該野生真菌為古巴栓孔菌（Tramtes cubensis），屬于真菌門（Eumycota），擔子菌亞門（Basidiomycotina），層菌綱（Hymenomycetes）非褶菌目（Aphyllophorales） ，多孔菌科（Polyporaceae），栓菌屬（Trametes）。

關鍵詞：野生大型真菌;古巴栓孔菌;ITS序列;鑒定

中圖分類號： S646 ? ? ? 文獻標識碼： A ? ? ? DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2020.07.001

Abstract： In this study， a wild macro-fungus was utilized as the materials， which collected from Xiamen botanical garden in Xiamen city （Fujian province）. In order to investigate the fungus， the morphological characteristics of its fruiting body and the growth status of its mycelium were observed， and the molecular identification was performed in this experiment. The genomic DNA of fungal hyphae was extracted， and the ITS region of rDNA was amplified by PCR method using specific primers， and then sequenced. The sequence similarity comparison was using BLAST searches in GenBank， then the phylogenetic tree was built by NJ（Neighbor-Joining） method using Mega6 software. The results showed that the wild fungus was identified as Eumycota， Basidiomycotina， Hymenomycetes ，Aphyllophorales， Polyporaceae， Tramtes cubensis， a kind of wood rotting fungus.

Key words： wild macrofungi; Trametes cubensis; ITS sequence; identification

中國是世界上較早認識和利用多孔菌的國家，在公元25年—220年，《神農本草經》 里就有關靈芝的記載[1]，李時珍《本草綱目》中記錄的更加詳細[2]。我國野生菌資源豐富，但是利用開發的較少。栓菌屬中一些菌物具有很高的藥用價值和生物學活性，由于栓菌屬分類混亂且不易被劃清屬間界限[3-4]，極大地影響了栓菌屬的開發與利用。理清他們之間的親緣屬關系對研究多孔菌的藥用價值具有重要的指導意義。

栓菌屬（Trametes）是一類木腐菌，大多數生長在倒腐木或樹樁上。栓菌屬（Trametes）種類多，分布廣，在熱帶至亞熱帶的各種森林生態系統中均有分布，在我國主要分布在四川、湖南、廣東、廣西、云南、福建、海南等地。栓菌屬中部分種具有良好的藥用價值，可以用來治療炎癥、肺結核、支氣管、降血糖抗癌和抗氧化等[5-9]，陳俊威和徐旭東[10]研究發現紅栓菌的胞外多糖具有抗腫瘤提高免疫力的作用。任剛[11]研究了栓孔菌對癌細胞具有一定的增殖抑制作用。栓菌屬具有一定的工業應用價值，司靜等[12]研究了東方栓孔菌發酵所得粗酶液對結晶紫脫色效果較好。古巴栓孔菌的藥用功能目前還尚未有報道，確定其種屬關系為古巴栓孔菌的進一步開發利用與馴化栽培奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試子實體 供試子實體采自福建省廈門市廈門熱帶植物園，通過組織分離得到斜面菌種，命名為TNCY002，保藏于天津農學院食用菌研發中心。

1.1.2 菌種活化培養基 PDA固體培養基（%）：馬鈴薯20，葡萄糖2，瓊脂2，pH值自然。

1.1.3 PCR擴增的引物

ITS1 （5-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3）

ITS4（5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3）

1.2 試驗方法

1.2.1 形態特征觀察 觀察子實體顏色，紋路等典型外觀形態特征，測量子實體長度，寬度，厚度，拍照。將子實體組織放于25 ℃下靜置培養8 d菌絲長滿平板。

1.2.2 菌絲DNA提取及凝膠電泳檢測 在菌絲中加入液氮快速研磨至粉狀，稱取質量為0.1 g菌絲的粉末于1.5 mL的離心管中，然后按照DNA提取試劑盒（天津蘭瑞生物科技有限公司）說明書進行操作，獲取基因組DNA，將提取的DNA置于-20 ℃保存備用。取DNA樣品5 μL進行1%瓊脂糖凝膠電泳30 min，用凝膠成像系統觀察基因組DNA的提取質量并拍照記錄。

1.2.3 ITS-PCR擴增及序列比對 以基因組DNA為模板，采用真菌通用引物ITS1和ITS4 進行PCR擴增。rDNA-ITS 擴增反應體系（20 μL）：10×PCR buffer 2 μL，dNTP 1.6 μL，ddH2O 10.9 μL，ITS1 1.2 μL，ITS4 1.2 μL，模板3 μL，Taq酶0.1 μL。PCR擴增反應條件：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，40個循環，最后72 ℃延伸5 min，4 ℃終止。

將PCR擴增產物進行電泳驗證后，送至天津生物公司進行測序。測序結果序列在 NCBI進行核酸序列BLAST比對分析。

1.2.4 系統發育分析 在NCBI上下載同源序列，將TNCY002的ITS序列通過BLAST與GENBANK數據庫進行比對，選取一些與該序列同源性較高的序列，以及同屬不同種的真菌序列;利用MEGA6.0軟件采用NJ（Neighbor-Joining）鄰接法構建系統發育樹，測試的重復數（number of replicates）選擇1000次。根據發育樹分支處的bootstrap值的大小確定供試菌株的種屬關系。

2 結果與分析

2.1 子實體生態環境調查及形態鑒定

供試菌株子實體采集于福建省廈門市廈門植物園的一顆枯樹上，共采集4個子實體。采集的野生真菌的子實體形態特征如圖1，子實體外形較大，幼小期呈灰白色。成熟期的子實體顏色變深，呈灰褐色或深褐色。木栓質，無菌柄，側生。菌蓋（9.3～13.5） cm×（6.8～7.2） cm，厚7.3～14.2 mm，半圓形或近似圓形，菌蓋呈灰褐色，有較寬同心環帶及棱紋，菌蓋邊緣薄，菌肉為深褐色，中部較厚。菌蓋中心處常有褐色小疣凸。

菌絲形態見圖2，菌絲都以接種塊為中心，向外生長成圓形絨毛狀，菌絲呈白色同心環狀，環間凹陷，菌絲邊緣較整齊。在平板內不分泌色素。平板菌絲培養8 d后即可長滿。斜面菌絲培養8 d后會沿著玻璃壁長出氣生菌絲。

2.2 菌絲DNA提取及凝膠電泳檢測

對菌絲體進行DNA提取，電泳條帶清晰、較明亮，無明顯后拖尾現象（圖3），提取的基因組DNA可用于后續試驗。

2.3 ITS-PCR擴增及序列比對

以提取的DNA為模板，ITS1、ITS4 為引物進行擴增，擴增產物電泳后出現了清晰明亮的單一帶，結果顯示片段大小約為500～700 bp之間（圖4）。

2.4 TNCY002的系統進化分析

將PCR擴增產物送樣測序，得到的序列長度為645 bp，序列在GenBank上的登錄號是MN068933.1。通過MEGA6.0得到的系統發育樹如圖5。

ITS序列測定結果表明，PCR擴增出來的產物長度為645 bp，登錄NCBI經過BLAST將測序結果進行比對，構建出進化樹如圖5所示， TNCY002與古巴栓孔菌JN164922.1 （Trametes cubensis）遺傳距離最近，經NCBI上比對相似度高達99.84%，表明TNCY002和古巴栓孔菌為相同種屬，即供試菌株屬于真菌門（Eumycota），擔子菌亞門（Basidiomycotina），層菌綱（Hymenomycetes）非褶菌目（Aphyllophorales） ，多孔菌科（Polyporaceae），栓菌屬（Trametes），古巴栓孔菌（Tramtes cubensis）。

3 結論與討論

我國是一個生物多樣性的國家，栓菌作為森林中最為常見的一類白腐菌，分布廣，種類多。栓菌屬的菌株形態相似度極高，導致對其錯誤的命名，嚴重影響了栓菌屬菌物在實際生產中的應用。Linnateus從1753最早開始對多孔菌科的分類進行研究，自1835年Fries建立的多孔菌屬，1874年Fries在多孔菌科里劃分了10個種屬，分別是多孔菌屬（polyporus），栓菌屬（Trametes），牛肝菌屬（Boletus），牛舌菌屬（Fistulina），迷孔菌屬（Daedalea），大孔菌屬（Favolus），蜂窩孔菌屬（Hexagona），膠皺孔菌屬（Merulius）等[13]，其中栓菌屬菌物是一類廣泛存在于大自然的大型真菌。迄今為止，栓菌屬中被馴化的有云芝、香栓菌[14]、血紅栓菌等。但是對于栓菌屬中的古巴栓孔菌目前對其藥用價值及生理活性研究較少。Olou B A等[15]， Justo A等[16]只研究了栓菌屬的分類及菌絲的結構特征。

野生菌資源的鑒定是其開發利用的前提和基礎。本試驗采用ITS序列，依據序列相似性<95%可鑒別為相同科;95%～99%可鑒別為相同屬;>99%可鑒別為相同種[17]。本試驗得出鑒定結果是供試菌株TNCY002為栓菌屬（Trametes）古巴栓孔菌（Trametes cubensis）。

參考文獻：

[1]李明焱. 《神農本草經》中靈芝的品屬及功效——靈芝研究溯源及其評價[C]// 中醫經典理論內涵與臨床應用學術研討會暨醫史文獻分會、中醫經典與傳承研究分會（籌）學術年會論文集， 中國浙江杭州， 2012.

[2]高坤， 馮杰， 顏夢秋， 等. 靈芝液態發酵高產胞外多糖菌株篩選及多糖特性分析[J]. 菌物學報， 2019，38（6）：886-894.

[3]趙繼鼎， 徐連旺， 張小青. 栓菌屬和它的親緣屬屬界劃分的研究[J]. 真菌學報， 1983（4）：213-220.

[4]張小青， 袁璟， 肖亞中， 等. 基于ITS序列的栓菌屬部分種的分子分類初步研究（英文）[J]. 菌物學報， 2006（1）：23-30.

[5]王柯慧. 高等菌類偏腫栓菌子實體多糖的抗炎及血管保護作用[J]. 國外醫學（中醫中藥分冊）， 1996（4）：46.

[6]趙宇， 包海鷹， 閆俊， 等. 香栓菌提取物的止咳化痰作用及耐缺氧藥理活性研究[J]. 菌物學報， 2018，37（8）：1070-1081.

[7]陳俊威， 徐旭東. 紅栓菌胞外多糖抗腫瘤及免疫藥理作用[J]. 中成藥， 2005（10）：1217-1218.

[8]蔣剛， 胡友旭， 丁明若， 等. 大白栓菌降糖活性部位篩選[J]. 食品科技， 2012，37（3）：27-30.

[9]韓鵬， 邊勇， 陳青君， 等. 野生白樺茸的分離鑒定及其生物學特性[J]. 應用與環境生物學報， 2018，24（3）：576-582.

[10]陳俊威， 徐旭東. 紅栓菌胞外多糖抗腫瘤及免疫藥理作用[J]. 中成藥， 2005（10）：1217-1218.

[11]任剛.多孔菌抗腫瘤活性評價及巨多孔菌有效成分分離、結構鑒定及誘導導HeLa細胞凋亡的分子機理研究[D].杭州：浙江大學，2006.

[12]司靜，崔寶凱，戴玉成.東方栓孔菌在染料脫色中的應用及其脫色條件的優化[J].基因組學與應用生物學，2011（3）：364-371.

[13]趙繼鼎， 徐連旺， 張小青. 中國多孔菌科分類系統的研究[J]. 微生物學報， 1982，22（3）：218-232.

[14]ROY A. Studies on Indian polypores. V. Morphological and cultural characters of Trametes cubensis[J]. Canadian journal of botany， 1982，60（6）：1012-1015.

[15]OLOU B A， KRAH F， PIEPENBRING M， et al. Diversity of Trametes （Polyporales， Basidiomycota） in tropical Benin and description of new species Trametes parvispora[J]. MycoKeys， 2020，65：25-47.

[16]JUSTO A， HIBBETT D S. Phylogenetic classification of Trametes （Basidiomycota， Polyporales） based on a five-marker dataset[J]. TAXON， 2011，60（6）：1567-1583.

[17]樊永軍， 趙艷玲， 閆偉. 賀蘭山兩株大型真菌物種分子鑒定與系統地位分析[J]. 廣東農業科學， 2014，41（2）：153-156.