翻譯組學相關技術的應用研究進展

羅錦堂 張曉娟 奚英杰 張林林 郭益文 丁向彬 郭宏 李新

摘 ? ?要：隨著高通量測序技術和質譜技術的興起與發展，全基因組學、轉錄組學、蛋白質組學等多種組學技術被廣泛的應用于生物研究領域用以深入探究細胞或組織中基因和蛋白的表達模式及調控機理。轉錄組測序和蛋白質譜技術是當前研究基因和蛋白功能的主要技術手段，但因從mRNA到蛋白質的翻譯過程受到轉錄及轉錄后水平、翻譯及翻譯后水平等多種不同水平的調控影響。轉錄組結果和蛋白組結果二者間相關性較低，匹配度較差，無法對基因和蛋白的功能及調控途徑進行最為有效的機制分析，而翻譯組學技術作為蛋白質組學與轉錄組學之間的“橋梁”，可以提供參與核糖體翻譯過程的RNA信息，顯著增加了RNA和蛋白質之間的相關性，揭示了RNA到蛋白質的中間進程，為闡釋轉錄本豐度與蛋白質豐度之間差異原因，分析遺傳信息從核苷酸到氨基酸的過程途徑提供了技術支撐。本文介紹了目前翻譯組學中最常用的四種技術方法的原理、應用以及優缺點，以期為將來利用翻譯組學技術手段開展相關研究提供參考。

關鍵詞：轉錄組學;蛋白質組學;核糖體新生肽鏈復合物;mRNA;翻譯組學

中圖分類號：Q81 ? ? ? ? ?文獻標識碼：A ? ? ? ? ?DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2020.07.004

Abstract： With the rise and development of high-throughput sequencing technology and mass spectrometry technology， genome-wide genomics， transcriptomics， proteomics and other omics technologies are widely used in the field of biological research to deeply explore genes in cells or tissues and protein expression patterns and regulatory mechanisms. Transcriptome sequencing and protein profiling technologies are the main technical means for studying the function of genes and proteins. However， because the translation process from mRNA to protein is affected by many different levels of regulation， including transcription and post-transcription level， translation and post-translation level， transcription. The results of transcriptomics and proteomics are relatively low in correlation， and the degree of matching is poor. It is impossible to analyze the functions and regulatory pathways of genes and proteins in the most effective mechanism. "Bridge" can provide RNA information involved in the translation process of ribosomes， significantly increasing the correlation between RNA and protein， revealing the intermediate process of RNA to protein，to explain the reason for the difference of abundance between transcript and protein， provides technical support for the analysis of the genetic information from nucleotides to amino acids. This article introduced the principles， applications， advantages and disadvantages of the four most commonly used technical methods in translation omics at present， in order to provide a reference for future research using translation omics technology.

Key words： transcriptomics; proteomics; ribosomal nascent peptide complex; mRNA; translationomics

在各種生命進程中，蛋白質的功能發揮均受到有機體的精準調控。根據中心法則可知，產生一個可以發揮功能的蛋白質需要經歷以下4個調控步驟即：RNA的合成調控（包括表觀遺傳和轉錄調控）、RNA的降解調控、蛋白質的合成調控（翻譯調節）和蛋白質的降解調控[1]。隨著多種組學技術的發展，研究人員通過構建數學模型和組學測量分析表明，蛋白質的合成調控占整個蛋白質合成過程中總數的一半以上[2]。因翻譯調控的存在，轉錄組學和蛋白質組學產生的結果并不直接相關， mRNA的表達豐度不能真實地反應蛋白質的表達豐度，即當mRNA豐度低時，可能在翻譯后期突然大量翻譯致使蛋白表達豐度顯著增加，反之，mRNA豐度高時，也可能發生翻譯暫停，從而導致蛋白質豐度減低。Maier等[3]對多對轉錄組和蛋白質組的對應結果進行比較研究發現，mRNA表達水平與其編碼蛋白的表達水平間的相關系數為0.01至0.5。由此可知，以mRNA 的表達水平作為判斷蛋白質表達水平的依據有可能產生較大的分析誤差。翻譯組學主要用于研究翻譯過程中涉及的所有元素，如正在翻譯的mRNA、調控RNA、新生肽鏈及各種翻譯因子等。它的出現讓RNA到蛋白質的中間進程得以呈現，作為連接轉錄組學與蛋白質組學的橋梁，更準確地揭示遺傳信息的傳遞過程和調控機制。

1 轉錄組學、蛋白質組學及翻譯組學的比較

轉錄組測序（RNA-Seq）主要研究特定細胞在某一功能下所能轉錄出來的RNA集合，在中心法則中mRNA是蛋白質合成的直接模版，RNA-Seq可以直接地反映mRNA在細胞中的種類和數量，同時還可以檢測mRNA的序列變異和可變剪接[4]，因此，RNA-Seq被廣泛用于研究目標基因的表達水平，闡明動植物生長發育和應激反應的機制。特別是對于未知基因組序列的物種，可以從轉錄組序列中推斷出蛋白質序列，對于這些物種的開發利用發揮了重要作用。從mRNA到蛋白質的翻譯過程分別受轉錄調控、轉錄后調控和翻譯水平調控，并且翻譯后的修飾、活化及降解調控也對蛋白質豐度有重要影響，所以僅憑RNA-seq無法準確且真實反映細胞內蛋白質水平。

隨著分子生物學相關技術的發展和成熟，蛋白質組學在分子生物學研究中得到了廣泛的應用，其中貫穿整個蛋白質組學的通用技術為質譜技術（MS）[5]。質譜技術為幫助研究人員定量及定性研究蛋白質提供了強有力的方法手段，同時質譜技術也因為可以從復雜的混合物中較易獲得有用的相關信息等優點成為蛋白質組學研究中發展最快的技術手段。特別是基于二次質譜技術的液相色譜與質譜技術聯用的方法（LC-MS/MS）已成為研究蛋白質最有效的方法之一。質譜技術的基本原理是先將蛋白質經胰酶消化成肽片段的混合物，隨后在質譜儀中進行檢測，具有不同質荷比（即質量和電荷的比值：M/Z）的肽段被檢測器分別收集進而得出M/Z值，獲得實際的一級質譜和二級質譜。之后再通過與蛋白質序列數據庫中的蛋白質經胰酶消化后所產生的理論上的一級質譜和二級質譜峰圖進行比較鑒定蛋白質的類型和含量。與之前的雙向電泳等方法相比質譜法具有靈敏度高和速度快的優點，并且可以同時提供蛋白質鑒定和定量信息[6]。同時，質譜技術還可以富集復雜的蛋白質混合物中的目標蛋白質，識別翻譯后修飾的位點，此外，許多調控修飾，如磷酸化、乙酰化和甲基化均可以通過質譜進行大規模分析。然而，質譜法在蛋白質鑒定方面也存在一定的局限性，主要體現在解析度低，難以檢測到豐度較低的蛋白;蛋白質本身的理化性質也會影響質譜檢測，而且如疏水性膜蛋白、結構抗消化的致密蛋白以及易于降解的蛋白等蛋白都不容易被檢測到[7];而且，質譜法僅能鑒定已知的蛋白質，無法鑒定新的或未知的蛋白質。

mRNA通過與核糖體結合起始蛋白質翻譯進程，在整個翻譯過程中包括起始、延伸和終止3個階段。許多研究均已證明翻譯進程中的第一個階段即起始階段是蛋白質合成的主要限速步驟[8-10]。在真核生物中，核糖體小亞基40S首先與翻譯起始因子結合并識別mRNA5'端的甲基化帽子。待mRNA與小亞基結合后，tRNA（tRNAMet）通過反密碼子與mRNA中AUG起始序列結合，形成40s起始復合物[11]。然后核糖體大亞基（60S）與起始復合物相結合。結合后完整的80S核糖體-mRNA翻譯起始復合物開始合成肽鏈[12-13]。在合成過程中，其余核糖體也可以與該mRNA結合從而形成多聚核糖體（polysome）。翻譯過程中核糖體-新生肽鏈復合物（Ribosomenascent-chaincomplex，RNC）中的mRNA即是能翻譯成蛋白的mRNA，而沒有形成復合物的mRNA，則無法被翻譯成蛋白質。而翻譯組學研究主要是測定參與核糖體翻譯事件中的RNA序列，因此，翻譯組測定在一定程度上可以測定出所有待翻譯蛋白，為全面揭示mRNA到蛋白質的翻譯調控機制提供了有效手段。

2 翻譯組研究常用技術

翻譯組的廣義定義包括直接參與翻譯過程的所有元素，如結合核糖體的mRNA、核糖體、tRNAs、一些調節性RNA（miRNA、lncRNA等）、新生多肽鏈和各種翻譯因子。由于廣義的翻譯組需要研究的內容較多，極大增加了研究的難度，故而引申出翻譯組的狹義定義，即主要特指正在參與翻譯過程的mRNA，因為mRNA對蛋白質的合成提供了藍圖，所以研究翻譯中的mRNA就成了研究翻譯組學的首要任務。目前，翻譯組學研究主要有多聚核糖體圖譜技術（Polysomeprofiling）、翻譯譜分析技術（RNC-Seq）、核糖體足跡譜技術（Ribosomeprofiling）、翻譯核糖體親和純化技術（Translating Ribosomeaffinitypurification，TRAP）[1]。

2.1 多聚核糖體圖譜技術

多聚核糖體圖譜技術（Polysome profiling）始于20世紀60年代，是一種基于蔗糖密度梯度超速離心的蛋白質分析技術。核糖體是大多數高密度細胞中最大的大分子細胞器，一個結合了許多核糖體的mRNA分子在蔗糖梯度中沉降系數更大故沉淀的速度更快。在蔗糖密度梯度離心后，游離RNA和蛋白質由于其密度小而漂浮在蔗糖梯度的頂部。蔗糖溶液從底部緩慢泵出，可以在蔗糖溶液分離出與不同數量核糖體結合的mRNAs。然后通過Northernblot、微陣列或RT-PCR分析各組分中的結合了不同數量核糖體的mRNA，以反映轉錄物的翻譯分布。但當環境脅迫時翻譯的全局狀態會發生巨大變化[14]。例如，在高滲透壓下觀察到單個核糖體結合的mRNA數目就會顯著增加即含有一個核糖體的mRNA會變多，含有多個核糖體的mRNA就會變少，而在氧化應激壓力下結合到多個mRNA的核糖體數目會顯著增加，結合單個核糖體的mRNA數目變少等[15]。多聚核糖體圖譜技術通常還用于轉座子的研究[16]。在離心過程中根據與mRNA結合的核糖體的數量進行沉淀，并在分級分離后將有效翻譯的mRNA鑒定并合并，之后再使用DNA芯片或RNA-seq對mRNA池進行定量，以得出轉座子的數據。多聚核糖體圖譜技術的主要缺點是難以對全翻譯mRNAs（RNC-mRNA）進行深入分析。由于蔗糖梯度的體積很大，每個部分的RNC-mRNA濃度都比較低，同時高濃度的蔗糖進一步抑制了某些酶類反應。從蔗糖梯度中回收的RNC-mRNA總量通常僅足以滿足RT-PCR等試驗操作，除非使用大量的起始材料，否則很難回收到足夠的mRNA用于全譜分析，限制了后續功能研究的深入開展。

2.2 翻譯譜分析技術

2013年，暨南大學張弓教授實驗室發明了全長翻譯mRNA測序技術也稱翻譯譜分析技術（RNC-seq）[17]，有效地解決了多聚核糖體圖譜技術樣本回收量低的難題。RNC-seq技術通過將細胞裂解液注入單一濃度（約30%）的蔗糖緩沖液中，經超速冷凍離心從游離mRNA和其他細胞成分中分離出與核糖體結合的所有翻譯mRNA，隨后進行離心并抽提沉淀，提取出核糖體新生肽鏈復合物，最后進行高通量測序，就可以得到所有正在翻譯mRNA的全長信息以及RNC-mRNA的豐度和類型。通過優化離心和蔗糖緩沖條件，RNC的回收率可以高達90%以上，且回收的RNC仍然保留了翻譯活性。RNC-Seq技術的難點在于完整RNC-mRNA復合體的分離，RNC的脆弱性導致核糖體離解和mRNA斷裂及降解。且翻譯譜分析技術無法明確分析出在翻譯過程當中核糖體究竟結合到mRNA全長的哪一位置，即確定不了核糖體分布的位置信息。因此，RNC-mRNAs的分析結果可能存在一定的偏差與缺陷。

2.3 核糖體足跡譜技術

核糖體足跡譜技術（Ribo-seq）是利用核糖體印跡的經典分子方法[18]，體外翻譯的mRNA經過核酸酶處理以破壞未由核糖體保護的區域。這種處理留下了大約30個核苷酸的“足跡”，可以將其定位回原始mRNA，以明確翻譯核糖體的確切位置。Ribo-Seq，首次由Ingolia[19]等研究發現。他們用低濃度的RNase處理細胞裂解物來降解沒有被核糖體保護的mRNA，而由核糖體保護的RNA片段則不會受到影響。而后通過下一代測序（NGS）分析20-30nt左右的mRNA片段（稱為核糖體保護片段跡，RFPs）揭示核糖體的位置和密度。基于位置信息，可以推斷核糖體在每個轉錄體上的分布和密度、核糖體具體滑動到哪一密碼子，據此可以進一步推斷出起始密碼子位置（包括非ATG起始）、密碼子使用偏差、上游ORF（uORFs）[20]等信息，這些信息是其他翻譯組學技術無法獲得的。近幾年，一種更加優化的核糖體序列分析方法即超分辨率核糖體分析（super-resolutionribonomeprofiling）被開發出來。HsuPollyYingshan等[21]用該技術發現了擬南芥基因組注釋中缺失的蛋白質，證實了計算預測的非規范翻譯事件，并發現了可能在植物中具有重要功能的未注釋的小蛋白質。然而核糖體圖譜技術操作比較復雜，且對初始樣本的需求量也比較大。有些RNA結合蛋白可以保護在結合區域的RNA不受RNase的降解而存留下來，但這些被保護留存下了的RNA片段并不是處于被翻譯的狀態[22]。此外，Ribo-seq還經常生成許多被比對到非編碼RNA的“RFP”，這表明該分析存在較大的假陽性率。

2.4 翻譯核糖體親和純化技術

翻譯核糖體親和純化技術（TRAP）是由Gerber等人報道提出的，該技術主要利用組織特異性啟動子表達結合核糖體大亞基的L25蛋白質，并在C-端連接親和標簽，之后轉化細胞，隨后利用特異性抗體結合含有標簽的核糖體，進而抓取獲得結合在核糖體上正在翻譯的mRNA，以供后期分析研究。TRAP技術通過對核糖體保護的mRNA片段進行深度測序，可以發現新的編碼轉錄本和蛋白質同工型，并對翻譯效率進行精確測定。TRAP技術的優點是不需要固定或解離組織，也不需從組織中提取細胞來捕獲細胞類型特異性mRNA。與其他方法相比，該優點使TRAP的靈敏度更高。此外，TRAP轉基因用增強的綠色熒光蛋白（EGFP）標記待研究的細胞類型，因此可以在免疫組化或電生理研究中可視化。與其他基因表達譜分析方法相比，TRAP的另一個優勢在于它揭示了細胞翻譯后的mRNA含量[23]。核糖體親和純化技術的主要難點在于，如果是直接在動物層面進行操作則需要首先制備相關轉基因動物模型，如果要對原核生物或細胞樣本操作則需要構建表達載體，此過程繁瑣、耗時，且只能適用于已經建立穩定轉化體系的物種。故該項技術在應用方面依然存在一定的局限性。

3 總結與展望

綜上所述，基于mRNA轉錄為核心的轉錄組技術并不能直接反應出蛋白質的翻譯水平，且翻譯調控比轉錄調控更快、更敏感，同時可以解釋轉錄組和蛋白質組之間的差異，對翻譯調控的研究可以幫助我們更好地理解基因表達調控機制。翻譯組研究技術方法的未來改進方向將集中于減少測序時所需要的樣品量（例如，單細胞轉化組學），增加樣品種類（不同細胞和組織等）、提高靈敏度，降低假陽性，增加空間和時間分辨率，降低成本和操作復雜性等方面。目前，筆者從基因組到轉錄組的相關調控機理研究的較為透徹，但從轉錄組到蛋白組的調控機理研究還非常薄弱，而翻譯組恰恰是連接轉錄組和蛋白組的橋梁。

傳統的多組學聯合分析大多局限在基因組、轉錄組、蛋白組和代謝組等，隨著翻譯組的進步與發展，聯合翻譯組進行的多組學分析已經表現出極高的研究價值。如廣西大學的羅祖朋[24]通過MeRIP-Seq和RNC-Seq的聯合運用，探究高脂營養條件對小鼠肝臟的m6A甲基化模式和正在翻譯的mRNA的影響，結果顯示甲基化差異基因在脂質代謝、翻譯等相關重要生物學過程中顯著富集。Wang等[25]通過分析了全基因組范圍內的mRNA，RNC-mRNA和蛋白質的相對豐度，對肺癌細胞和正常支氣管上皮細胞進行比較，發現mRNA長度顯著的促進了翻譯調節。雖然，目前翻譯組學的研究還處于比較初級階段，但相信隨著研究的持續深入，翻譯組學在揭示蛋白翻譯奧秘、豐富和發展分子生物學理論等方面，將體現出特有的重要價值。加入了翻譯組的多組學聯合分析將有助于獲得更加全面的分子生物學相關信息。

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