蛋白桑葉多酚提取工藝的優化及其抗氧化、抑菌活性

陳向陽 ，穆愛潔，汪蒙蒙，付婕妤，陳永霞，王衛東，吳永祥*

（1.黃山學院生命與環境科學學院，安徽 黃山 245041；2.黃山祁弘韻蛋白桑農業科技有限公司，安徽 黃山 245612；3.黃山峰源生物科技有限公司，安徽 黃山 245600）

蛋白桑Morus albaL.又稱飼料桑，是我國經過長期選育、改良、優化的新型品種，具有區域適應性和抗逆性強、產量高等優點，已在許多地區得到大力推廣［1］。桑葉主要化學成分包括多糖、生物堿、多酚、黃酮等［2-3］，具有抗氧化、抗炎、降血糖、抑制胰脂肪酶等多種生物活性［4-6］，其中多酚是一種非常重要的次生代謝產物［7］，目前已有關于該成分提取工藝的報道［8-10］。但目前國內外學者都是基于單一的溶劑法或超聲法提取蛋白桑葉多酚，尚未利用表面活性劑十二烷基硫酸鈉（SDS）的增溶作用來協同超聲提取，而且缺少藥理作用的研究。因此，本實驗優化蛋白桑葉多酚的提取工藝，并評價其抗氧化、抑菌活性，以期為該資源綜合開發利用提供依據。

1 材料

1.1 試劑與藥物 蛋白桑葉由黃山祁弘韻蛋白桑農業科技有限公司提供，于2018 年10 月采自安徽省祁門縣閃里鎮，經黃山學院生命與環境科學學院胡長玉教授鑒定為桑屬桑科植物蛋白桑Morus albaL.的葉。福林酚試劑、十二烷基硫酸鈉（SDS）、丹寧酸、維生素C、DPPH、ABTS 等（美國Sigma 公司）；蛋白胨、牛肉膏、瓊脂（北京陸橋技術股份有限公司）。

1.2 儀器 SQ510C 型高壓滅菌器（重慶雅馬拓科技有限公司）；SpectraMax-190 型全波長酶標儀（美國Molecular Devices 公司）；SCQ-5201C 型數控加熱功率可調型超聲波清洗器（上海聲彥超聲波儀器有限公司）。

2 方法與結果

2.1 多酚提取物制備 取干燥蛋白桑葉粉末2.0 g，按照1∶15 料液比加入0.6%SDS、60%乙醇，調節超聲溫度50 ℃，超聲功率200 W，超聲時間10 min，將提取液置于離心管中，3 000 r/min離心15 min，取上清液濃縮，即得。

2.2 多酚含有量測定 參考文獻［11］方法，并作適當修改。精密配制25、50、75、100、150 μg/mL單寧酸對照品溶液，各取0.05 mL，與0.05 mL 福林酚試劑（0.25 mol/L）一同置于1.75 mL離心管中混合反應3 min，加入1 mL 碳酸鈉溶液（0.7 mol/L），室溫下靜置1 h 后顯色，精密吸取0.2 mL 反應液，置于酶標儀上，在750 nm 波長處測定吸光度。以溶液質量濃度為橫坐標（X），吸光度為縱坐標（A）進行回歸，得方程為A＝0.001 7X+0.006 8（R2＝0.998 0），在25～150 μg/mL范圍內線性關系良好。根據上述方程，測定多酚含有量。

2.3 單因素試驗

2.3.1 SDS 用量 固定乙醇體積分數60%、料液比1∶15、超聲溫度50 ℃、超聲功率200 W、超聲時間10 min，考察SDS 用量0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%對多酚含有量的影響，結果見圖1。由此可知，SDS 用量小于0.4%時多酚含有量隨著其增加而升高，在0.4% 時達到最大值，為（11.49±0.04）mg/g，與未加SDS 比較差異具有統計學意義（P＜0.05）；SDS 用量大于0.4%時多酚含有量反而略有降低，可能是其達到臨界膠束濃度后對該成分增溶作用的影響不大，但對其他雜質影響較明顯［12］。因此，選擇 SDS 用量為0.2%～0.6%。

圖1 SDS 用量對多酚含有量的影響Fig.1 Effects of SDS consumption on polyphenols content

2.3.2 超聲功率 固定乙醇體積分數60%、料液比1∶15、SDS 用量0.6%、超聲溫度50 ℃、超聲時間10 min，考察超聲功率100、150、200、250、300、350 W 對多酚含有量的影響，結果見圖2。由此可知，超聲功率100～250 W 時多酚含有量隨著其增加而升高，在250 W 時達到最大值，為（11.28±0.20）mg/g，與100、150、200 W 比較差異具有統計學意義（P＜0.05）；超聲功率大于250 W時多酚含有量反而呈降低趨勢，可能是功率過高會使該成分發生分解［13］。因此，選擇超聲功率為200～300 W。

圖2 超聲功率對多酚含有量的影響Fig.2 Effect of ultrasonic power on polyphenols content

2.3.3 超聲溫度 固定乙醇體積分數60%、料液比1∶15、SDS 用量0.6%、超聲功率200 W、超聲時間10 min，考察超聲溫度30、40、50、60、70、80 ℃對多酚含有量的影響，結果見圖3。由此可知，提取溫度60 ℃時多酚含有量達到最大值，為（11.07±0.08）mg/g，與30、40、50 ℃比較差異具有統計學意義（P＜0.05）；提取溫度高于60 ℃時多酚含有量反而明顯降低（P＜0.05），可能是高溫會影響超聲空化效果，而且可引起該成分發生分解［14］。因此，選擇超聲溫度為50～70 ℃。

圖3 超聲溫度對多酚含有量的影響Fig.3 Effect of ultrasonic temperature on polyphenols content

2.3.4 超聲時間 固定乙醇體積分數60%、料液比1∶15、SDS 用量0.6%、超聲溫度50 ℃、超聲功率200 W，考察超聲時間5、10、15、20、25 min對多酚含有量的影響，結果見圖4。由此可知，超聲時間5～15 min 時多酚含有量隨著其延長而升高，在15 min 時達到最大值，為（10.47±0.23）mg/g，與5、10 min 比較差異具有統計學意義（P＜0.05）；超聲時間大于15 min 時多酚含有量反而略有降低，可能是長時間超聲振動會破壞該成分結構［15］。因此，選擇超聲時間為15 min，并且不進行后續考察。

圖4 超聲時間對多酚含有量的影響Fig.4 Effect of ultrasonic time on polyphenols content

2.3.5 乙醇體積分數 固定料液比1∶15、SDS用量0.6%、超聲溫度50 ℃、超聲功率200 W、超聲時間10 min，考察乙醇體積分數40%、50%、60%、70%、80%對多酚含有量的影響，結果見圖5。由此可知，乙醇體積分數40%～50%時多酚含有量隨著其增加而升高，在50% 時達到最大值，為（10.73±0.11）mg/g，與40%比較差異具有統計學意義（P＜0.05）；乙醇體積分數大于50%時多酚含有量反而降低，可能是乙醇體積分數過高會使蛋白質等大分子變性沉淀，阻礙該成分從組織細胞向溶劑的擴散［16］。因此，選擇乙醇體積分數為40%～60%。

圖5 乙醇體積分數對多酚含有量的影響Fig.5 Effect of ethanol concentration on polyphenols content

2.3.6 料液比 固定乙醇體積分數60%、SDS 用量0.6%、超聲溫度50 ℃、超聲功率200 W、超聲時間10 min，考察料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 對多酚含有量的影響，結果見圖6。由此可知，料液比為1∶25 時多酚含有量達到最大值，為（13.58±0.05）mg/g，與1∶10、1∶15、1∶20 比較差異具有統計學差異（P＜0.05），表明隨著溶劑用量升高該成分與溶劑的接觸面積增加，有利于其溶出，而擴散達到平衡后提取量不再升高［17］。因此，從濃縮成本考慮，選擇料液比為1∶25，并且不進行后續考察。

圖6 料液比對多酚含有量的影響Fig.6 Effect of solid-liquid ratio on polyphenols content

2.4 響應面法 在單因素試驗基礎上，選擇SDS用量（A）、超聲功率（B）、超聲溫度（C）、乙醇體積分數（D）作為影響因素，多酚含有量（Y）作為評價指標，采用4 因素3 水平響應面法優化提取工藝。因素水平見表1，結果見表2。

表1 因素水平Tab.1 Factors and levels

對表2 數據進行擬合，得到多元回歸方程為Y＝15.41-0.36A+0.16B+0.12C-0.12D+0.27AB+0.20AC-0.30AD+0.31BC+0.28BD+0.15CD-0.54A2-0.32B2-0.74C2-0.44D2，方差分析見表3。由此可知，模型P＜0.000 1，表明模型達到極顯著水平；失擬項P＞0.05，表明未知因素對結果影響較小；R2為0.916 8，為0.833 6，表明模型擬合程度良好；變異系數為1.65%，表明該模型重復性、可靠性理想；因素A、B、AB、AD、BC、BD、A2、B2、C2、D2均達到顯著（P＜0.05）或極顯著（P＜0.05）水平。響應面分析見圖7。

表2 試驗設計與結果Tab.2 Design and results of tests

表3 方差分析Tab.3 Analysis of variance

圖7 各因素響應面圖Fig.7 Response surface plots for various factors

由此得到，最優提取工藝為SDS 用量0.34%，超聲功率259.92 W，超聲溫度60.89 ℃，乙醇體積分數50.33%，多酚質量分數為15.48 mg/g，考慮到生產操作的實際情況，將其修正為SDS 用量0.34%，超聲功率250 W，超聲溫度60 ℃，乙醇體積分數50%。按照上述優化工藝進行驗證試驗，測得多酚質量分數為（15.11±0.21）mg/g，與預測值15.48 mg/g 接近（相對誤差為2.45%），表明模型預測性良好。

2.5 還原能力 參考文獻［18］報道，并作適當修改。取0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 mg/mL 提取液各50 μL，與1%鐵氰化鉀溶液、pH 6.6 磷酸緩沖液各50 μL 混合，置于50 ℃水浴鍋中反應20 min后取出，冷卻，加入10% 三氯乙酸50 μL，3 000 r/min 離心15 min，取上清液90 μL，加入蒸餾水100 μL、0.1%三氯化鐵10 μL，靜置10 min，在700 nm 波長處測定吸光度，以維生素C 為陽性對照，蒸餾水為空白對照，重復3 次，取平均值，結果見表4。由此可知，多酚還原能力與其質量濃度呈正相關（P＜0.05），IC50為0.116 mg/mL。

表4 多酚還原能力測定結果（，n=3）Tab.4 Results of reducing capacity determination of polyphenols（，n=3）

表4 多酚還原能力測定結果（，n=3）Tab.4 Results of reducing capacity determination of polyphenols（，n=3）

注：同列不同字母表示相應數據之間的差異具有統計學意義（P＜0.05）。

2.6 ABTS 自由基清除能力 參考文獻［19］報道，并作適當修改。將2.45 mmol/L 過硫酸鉀與7 mmol/L ABTS 自由基等量混勻后，靜置于暗處16 h，乙醇稀釋ABTS 自由基溶液直至在734 nm 處的吸光度為0.70±0.02，作為使用液。取0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mg/mL 提取液各50 μL、使用液100 μL，混勻后避光反應5 min，在734 nm波長處測定吸光度Ai；將100 μL 使用液與50 μL蒸餾水混勻，5 min 后在734 nm 波長處測定吸光度A0；將100 μL 乙醇與0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mg/mL 提取液各50 μL 混勻，靜置5 min，在734 nm 波長處測定吸光度Aj，以維生素C 為陽性對照，重復3 次，計算清除率，公式為清除率＝［（A0-Ai+Aj）/A0］×100%，結果見表5。由此可知，多酚清除能力與其質量濃度呈正相關（P＜0.05），IC50為0.014 mg/mL。

表5 多酚清除能力測定結果（，n=3）Tab.5 Results of scavenging capacity determination of polyphenols（，n=3）

表5 多酚清除能力測定結果（，n=3）Tab.5 Results of scavenging capacity determination of polyphenols（，n=3）

注：同列不同字母表示相應數據之間的差異具有統計學意義（P＜0.05）。

2.7 抑菌活性 采用濾紙片擴散法［20-21］。在培養基中加入含有大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、普通變形桿菌、枯草芽孢桿菌、綠膿桿菌的菌懸液各100 μL，涂布均勻，在直徑6 mm 的濾紙片中央加入10 μL 提取液，以二甲基亞砜為空白對照，對羥基苯甲酸丙酯為陽性對照，37 ℃下倒置培養24 h 后測定抑菌圈直徑。同時，將提取液依次稀釋至0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 mg/mL，參照文獻［22］報道的方法觀察抑菌圈，將首次出現抑菌圈所對應的提取液質量濃度作為最低抑菌濃度（MIC），結果見表6。由此可知，在0.05～0.8 mg/mL 質量濃度范圍內，多酚對5種細菌的抑制作用呈量效關系（P＜0.05），對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的MIC 均為0.2 mg/mL，而對普通變性桿菌、綠膿桿菌的MIC均為0.4 mg/mL。

表6 多酚抑菌活性測定結果（，n=3）Tab.6 Results of anti-bacterial activity determination of polyphenols（，n=3）

表6 多酚抑菌活性測定結果（，n=3）Tab.6 Results of anti-bacterial activity determination of polyphenols（，n=3）

注：同列不同字母表示相應數據之間的差異具有統計學意義（P＜0.05）。

3 討論

本實驗采用響應面法優化蛋白桑葉多酚提取工藝，測得多酚質量分數高達15.11 mg/g，較未添加SDS 提高了59.83%。代燕麗等［9］通過響應面法對上述工藝進行了優化，多酚得率提高了約38.8%，但仍低于本實驗結果，表明SDS 能顯著提高提取效率。

抗氧化實驗結果顯示，蛋白桑葉多酚具有顯著的還原能力，能有效清除ABTS 自由基，并與其質量濃度呈顯著正相關。吳黌坦等［23］對金邊桑葉多酚提取物的抗氧化作用進行了研究，發現其水提物對ABTS 自由基具有較強的清除能力，IC50值為41.25 μg/mL，高于本實驗的14 μg/mL，表明SDS協同超聲提取能較好地保留其抗氧化活性。抑菌實驗結果顯示，蛋白桑葉多酚對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、普通變形桿菌、枯草芽孢桿菌、綠膿桿菌均具有較好的抑制作用，并呈明顯的劑量依賴性，高欣妍等［24］發現桑葉乙醇提取物對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌均具有一定抑制作用，MIC 為0.3 mg/mL，高于本實驗的0.2 mg/mL，表明優化工藝能顯著增強上述活性。由此可知，加入表面活性劑SDS 協同超聲提取時，能較好地改善蛋白桑葉多酚的抗氧化、抑菌活性。