石榴瓤多糖提取工藝的優化及其抑制透明質酸酶活性

王占一，廖成斌，公金艷，趙春林，孫曉梅，向 蘭

（1.棗莊學院食品科學與制藥工程學院，山東 棗莊 277160；2.山東大學藥學院，山東 濟南 250012）

石榴Punica granatumL.是石榴科石榴屬多年生木本植物［1］，在我國栽培歷史悠久，擁有豐富的資源。石榴瓤為石榴果實的內果皮，存在于石榴籽假種皮外部間隙，《全國中藥炮制規范》規定石榴皮炮制方法為“除去雜質，去除殘留的內瓤及種子，洗凈，切塊，干燥，或洗凈，干燥后粉碎”［2］，可見在此過程中石榴瓤通常作為廢物被丟棄，造成資源浪費［3］。國內已有關于石榴皮多糖［4-6］、石榴葉多糖［7］、石榴籽多糖［8］的研究，但石榴瓤作為石榴果實結構的一部分，其所含的該成分鮮有關注。

多糖具有抗過敏［9］、調節免疫［10］、抗氧化［11］等多種生物活性，以及抑制酶活性的作用［12-13］，但關于石榴瓤多糖對透明質酸酶的抑制作用尚無報道。因此，本實驗采用Box-Behnken 設計優化石榴瓤多糖提取工藝，并測定它對透明質酸酶的抑制作用，以期為其開發利用提供參考依據。

1 材料

1.1 儀器 HN-CQY 低溫超聲波萃取儀（上海汗諾儀器有限公司）；XFB-200 小型多功能粉碎機（永康市小寶電器有限公司）；FA1104 電子分析天平（上海越平科學儀器有限公司）；UV-2000 紫外-可見分光光度計（上海尤尼柯儀器有限公司）；HH-S6 數顯恒溫水浴鍋（常州普天儀器制造有限公司）；SHZ-D（Ⅲ）循環水式真空泵（鞏義市予華儀器有限責任公司）；RE52CS-2 旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）；WFZ 真空冷凍干燥機（上海高致精密儀器有限公司）。

1.2 試劑與藥物 石榴于2018 年10 月采自山東省棗莊市嶧城區“萬畝石榴園”主產區，經棗莊學院閆志佩教授鑒定為石榴科石榴屬多年生木本植物石榴Punica granatumL，將新鮮樣品洗干凈后手工撕取瓤部分，陰干，粉碎后過60 目篩，備用。D-無水葡萄糖對照品（純度≥98%，上海源葉生物科技有限公司）；透明質酸酶（5 000 U/g）、透明質酸鉀（上海聯邁生物工程有限公司）；Ehrlich 試劑（上海如吉生物科技發展有限公司）；乙酰丙酮（西隴科學股份有限公司）；DNS 顯色劑（上海譽宇新材料科技有限公司）；抗壞血酸（天津市河東區紅巖試劑廠）。3，5-二硝基水楊酸、苯酚、濃鹽酸、濃硫酸、氯仿、正丁醇等均為分析純（國藥集團化學試劑有限公司）；水為蒸餾水，由棗莊學院生物學省級教學示范中心提供。

2 方法與結果

2.1 多糖提取與純化 精密稱取干燥的石榴瓤粉末10.0 g，置于500 mL 干燥錐形瓶中，加水至一定料液比，保鮮膜、橡皮筋封住瓶口后置于超聲波提取器中，設定超聲功率為300 W，在一定超聲溫度下提取一段時間后減壓抽濾，濾液定容至100 mL（濾液超過100 mL 時，旋轉蒸發儀將其濃縮至80 mL 左右后再定容），加入1/4 倍體積的氯仿-正丁醇混合溶劑（比例4∶1）攪拌30 min，3 000 r/min離心15 min，取上清液，重復3 次以除去蛋白質。將粗多糖溶液置于透析袋（截留分子量3 500 Da）中透析36 h 以除去小分子雜質，完畢后加入3 倍量無水乙醇，封口膜封好，靜置冷藏過夜，于第2 天過濾，濾餅復溶于水，再加入3 倍量無水乙醇，重復3 次以除去色素，得到白色多糖沉淀，真空冷凍干燥，即得精多糖，稱定質量。將精多糖用蒸餾水溶解并定容至50 mL，作為供試品溶液，測定得率、純度，公式分別為得率＝（樣品中多糖含有量/樣品質量）×100%、純度＝（樣品中多糖含有量/精多糖質量）×100%。

2.2 總糖含有量測定

2.2.1 對照品溶液制備 精密稱取干燥至恒重的D-無水葡萄糖對照品50 mg，蒸餾水定容至100 mL，即得（0.5 mg/mL）。

2.2.2 方法學考察

2.2.2.1 線性關系考察 采用苯酚-硫酸法［14］。將“2.2.1”項下對照品溶液依次稀釋至10、20、30、40、50、60、70 μg/mL，各取1 mL，置于10 mL具塞試管中，加入0.5 mL 5%苯酚溶液，搖勻，滴加5.5 mL 濃硫酸，搖勻，室溫下靜置30 min，在490 nm波長處測定吸光度。以溶液質量濃度為橫坐標（X），吸光度為縱坐標（A）進行回歸，得方程為A＝0.079 2X-0.005 5（r＝0.999 5），在1.43～10 μg/mL 范圍內線性關系良好。

2.2.2.2 精密度試驗 精密量取“2.2.1”項下對照品溶液，按“2.2.2.1”項下方法測定6 次，測得總糖含有量RSD 為1.26%，表明儀器精密度良好。

2.2.2.3 重復性試驗 精密稱取干燥的石榴瓤粉末適量，按“2.1”項方法制備6 份供試品溶液，按“2.2.2.1”項下方法測定，測得總糖含有量RSD 為1.48%，表明該方法重復性良好。

2.2.2.4 穩定性試驗 精密稱取干燥的石榴瓤粉末適量，按“2.1”項下方法制備供試品溶液，室溫下于0、2、4、8、12、16 h 按“2.2.2.1”項下方法測定，測得總糖含有量RSD 為0.85%，表明溶液在16 h 內穩定性良好。

2.2.2.5 加樣回收率試驗 精密稱取含有量已知的干燥石榴瓤粉末適量，按“2.1”項下方法制備6 份供試品溶液，精密加入“2.2.1”項下對照品溶液0.5 mL，按“2.2.2.1”項下方法測定，測得總糖平均加樣回收率為101.12%，RSD 為0.92%。

2.3 還原糖含有量測定 采用DNS 顯色法［14］。精密量取“2.2.1”項下對照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 于具塞刻度試管中，不足1.0 mL 的蒸餾水補足1.0 mL，加入3，5-二硝基水楊酸（DNS）顯色劑2.0 mL，沸水浴5 min 后用自來水冷卻，蒸餾水補至10 mL，于540 nm 波長處測定吸光度。以溶液質量濃度為橫坐標（X），吸光度為縱坐標（A）進行回歸，得方程為A＝0.017 2X-0.186 2（r＝0.999 3），在5～50 μg/mL范圍內線性關系良好。

2.4 多糖含有量測定 按“2.2”項下方法測定總糖含有量，按“2.3”項下方法測定還原糖含有量，多糖含有量＝總糖含有量-還原糖含有量。

2.5 提取工藝優化

2.5.1 單因素試驗

2.5.1.1 料液比 精密稱取石榴瓤粉末3.0 g，固定超聲時間35 min、超聲溫度45 ℃，考察粉末與水比例（料液比）1∶8、1∶12、1∶16、1∶20、1∶24、1∶28 對多糖得率的影響，結果見圖1。由此可知，隨著提取溶劑用量增加，多糖得率呈先升后降的趨勢，料液比為1∶20 時達到最大；進一步加大提取溶劑用量后，多糖得率反而略呈下降趨勢，其原因是溶劑量過多會增加該成分損失。因此，確定料液比為1∶20 左右。

圖1 料液比對多糖得率的影響Fig.1 Effect of solid-liquid ratio on polysaccharides yield

2.5.1.2 超聲時間 精密稱取石榴瓤粉末3.0 g，固定料液比1∶20、超聲溫度45 ℃，考察超聲時間20、25、30、35、40、45 min 對多糖得率的影響，結果見圖2。由此可知，提取20～35 min 時，多糖得率升高趨勢明顯；超過35 min 后，多糖得率反而略有下降，其原因是超聲時間過長時該成分結構會發生改變。因此，確定超聲時間為35 min左右。

圖2 超聲時間對多糖得率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic time on polysaccharides yield

2.5.1.3 超聲溫度 精密稱取石榴瓤粉末3.0 g，固定料液比1∶20、超聲時間35 min，考察超聲溫度25、35、45、55、65、75 ℃對多糖得率的影響，結果見圖3。由此可知，在25～45 ℃下，多糖得率升高趨勢明顯；超過45 ℃后，多糖得率反而呈下降趨勢，其原因是溫度過高時該成分會氧化變質或水解損失。因此，確定超聲溫度為45 ℃左右。

圖3 超聲溫度對多糖得率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic temperature on polysaccharides yield

2.5.2 Box-Behnken 設計 在單因素試驗基礎上，以料液比（A）、超聲時間（B）、超聲溫度（C）為影響因素，多糖得率為評價指標（Y），應用Design-Expert 8.0.6 軟件進行Box-Behnken 設計，優化提取工藝。因素水平見表1，結果見表2。

表1 因素水平Tab.1 Factors and levels

將表2 數據進行多元回歸擬合，得到方程為Y＝7.09+0.13A+0.090B+0.083C-0.15AB+0.28AC+0.090BC-0.18A2-0.27B2-0.37C2，方差分析見表3。由此可知，模型P＜0.000 1，表明模型達到極顯著水平；失擬項P＞0.05，表明未知因素對實驗結果影響較小；R2為98.96%，表明模型擬合程度良好，可代替真實點進行分析；各因素及其交互項、二次項均達到顯著（P＜0.05）或極顯著（P＜0.01）水平。

表2 試驗設計與結果Tab.2 Design and results of tests

表3 方差分析Tab.3 Analysis of variance

響應面分析見圖4。由此可知，固定超聲溫度（C）時，因素A（料液比）、B（超聲時間）對多糖得率的影響均呈倒U 型變化；A對響應面坡度的改變程度大于B，表明前者影響較大。同理，其他因素影響程度為A＞C、B＞C。

通過Design Expert 8.0.6 軟件對表3 數據進行分析，得到最優工藝為料液比1∶22.44，超聲時間35.30 min，超聲溫度48.50 ℃，多糖得率為7.14%，考慮到實際生產條件，將其修正為料液比1∶22，超聲時間35 min，超聲溫度48.5 ℃。在此優化工藝下進行3 批驗證試驗，測得多糖得率分別為7.14%、7.12%、7.13%，平均7.13%，與預測值7.14%接近，表明模型具有較好的穩定性。

圖4 各因素響應面圖Fig.4 Response surface plots for various factors

2.6 抑制透明質酸酶活性檢測

2.6.1 抑制率測定 采用Elson-Morgan 法［15］。按“2.1”項下方法測得精多糖純度約為75%，通過含有量換算，將其依次配制成0.1、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4、2.8、3.2 mg/mL 溶液，各精密量取0.5 mL 至10 mL 試管中，加入0.5 mL 透明質酸酶（500 U/mL）混勻，37 ℃下水浴20 min，取出試管，加入0.1 mL CaCl2溶液（2.5 mol/L）混勻，37 ℃水浴20 min，取出試管，加入0.5 mL 透明質酸鉀溶液（0.5 mg/mL）混勻，37 ℃下水浴40 min，取出試管，靜置5 min，加入2 滴NaOH 溶液（5 mol/L）、0.5 mL 乙酰丙酮溶液混勻，沸水浴15 min 后冰水浴冷卻5 min，取出試管，靜置10 min后加入蒸餾水0.5 mL、Ehrlich 試劑0.5 mL、濃HCl 2 mL，補加無水乙醇至10 mL，振搖混勻，靜置30 min后在530 nm 波長處測定吸光度，以相同質量濃度的抗壞血酸為陽性對照，計算透明質酸酶抑制率（R），公式為R＝［（A0-A）/A0］×100%，其中A0為對照組吸光度（以不加樣品、酶液、透明質酸鉀為空白對照），A為樣品組吸光度（以加樣品，不加酶液、透明質酸鉀為空白對照）。抑制曲線見圖5。

圖5 多糖對透明質酸酶活性的抑制曲線Fig.5 Inhibitory curves for polysaccharides on hyaluronidase activity

由此可知，在0.1～2.4 mg/mL 質量濃度范圍內多糖對透明質酸酶活性的抑制率明顯增加，在2.4 mg/mL 時最大，達67.2%，但超過2.4 mg/mL后其升高程度趨緩；多糖溶液質量濃度（X）與抑制率（Y）之間呈正相關，方程為Y＝26.12X+4.99（R2＝0.998 2），IC50為1.723 mg/mL；抗壞血酸IC50為0.816 mg/mL，表明其作用強于多糖。

2.6.2 酶抑制動力學分析

經前期預實驗得知，反應體系透明質酸酶反應初速率維持時間≥36 min。本實驗固定多糖溶液質量濃度為2.4 mg/mL，底物透明質酸鉀濃度為3.0 mmol/L，選擇透明質酸酶活性2.5、5.0、7.5、10.0、12.5 U/mL。研究分為2 組，1 組為實驗組，加入多糖；另1 組為空白對照組，不加入多糖而以空白溶液代替，測定反應初速率（V），以加入反應體系前的透明質酸酶活性為橫坐標，初速率為縱坐標繪圖，以確定多糖對透明質酸酶的抑制作用是否屬于可逆性抑制類型［16］，結果見圖6。由此可知，無論加或未加抑制劑，曲線均通過原點，表明多糖對透明質酸酶的抑制作用屬于可逆性抑制［17］。

圖6 透明質酸酶活性-反應初速率曲線Fig.6 Curves for hyaluronidase activity-initial reaction rate

以1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mmol/L 透明質酸鉀為底物，加入0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 mg/mL多糖溶液，測定其在18 min 時的吸光度。以反應速率的倒數（1/V）為縱坐標，加入反應體系前底物透明質酸鉀濃度的倒數（1/［S］）為橫坐標繪圖，以確定多糖對透明質酸酶抑制作用類型［18］，結果見圖7。由此可知，曲線在X軸的負半軸幾乎交于一點，屬于非競爭性抑制類型［19］，表明底物濃度升高不能降低多糖對透明質酸酶的抑制活性。

圖7 多糖Lineweaver-Burk 曲線Fig.7 Lineweaver-Burk curves for polysaccharides

3 討論

本實驗在單因素試驗的基礎上采用Box-Behnken 設計優化石榴瓤多糖提取工藝，得到最佳條件為料液比1∶22 g/mL，超聲時間35 min，超聲溫度48.5 ℃，多糖得率為7.13%，與預測值7.14%接近，表明工藝準確可靠。

透明質酸能在具有一定活性透明質酸酶的條件下水解，產生β-N-乙酰葡糖胺，后者可在堿的催化下與乙酰丙酮縮合而形成生色原，它在酸性條件下與Ehrlich 試劑縮合顯色，縮合產物在530 nm波長處有最大吸收，故通過可見分光光度法測定β-N-乙酰葡糖胺含有量可得知透明質酸被水解的程度，進而間接判斷透明質酸酶活性，該成分含有量越高，酶活性也越高，反之則越低，上述方法即為國際通用的Elson-Morgan 法。本實驗采用該方法測定石榴瓤多糖體外抑制透明質酸酶活性，發現其IC50為1.723 mg/mL，表明其抑制作用較強。

由此推測，石榴瓤多糖對透明質酸酶的抑制機理可能是前者作用于后者上的活性位點，并優先以非共價鍵結合，使后者無法再作用于底物透明質酸，導致其活性暫時喪失；或兩者以共價鍵的形式結合而發生反應，使后者結構改變，喪失其催化透明質酸水解的活性位點，從而永久性失活。