藏藥灰兜巴對糖尿病腎病大鼠足細胞損傷的改善作用

楊坤寶 ，龐宗然，尹長江，白穎慧，魯碧楠，于 寧，韓桂艷

（1.中央民族大學藥學院，北京 100081；2.承德醫學院，河北 承德 067000；3.承德醫學院附屬醫院，河北 承德 067000）

2017 年底，國際糖尿病聯盟公布了第八版全球糖尿病地圖。全球糖尿病（Diabetes Mellitus，DM）成人患者（20～79 歲）到2017 年已達到4.25 億，預計到2045 年，糖尿病患者可能達到6.42 億。其中我國患病人口最多，高達1.144 億［1］。而糖尿病腎病（Diabetic Nephropathy，DN）作為糖尿病最常見微血管并發癥，目前已成為導致終末期腎病（End-stage renal disease，ESRD）的最主要原因之一［2］。北大醫院最新統計結果顯示，我國DN 已經超過了腎小球腎炎相關慢性腎臟病，成為ESRD 的首要病因，估計患病人數已達2 400 萬［3］。目前臨床治療糖尿病腎病多以控制血糖、血壓為主，但并不能完全阻止其進展。因此，深入研究糖尿病腎病發病機制并尋找新的天然藥物，對于減緩該疾病發生發展具有重要意義。

藏藥灰兜巴又名灰蔸巴、閉口袋，為地蛛科地蛛屬卡氏地蛛（Atypus karschiDoenitz）在老茶樹根部所筑的巢穴，具有益氣健脾、滋補腎陰之功效，在四川峨眉山地區被世代相傳，用于糖尿病及其并發癥的治療［4］。本實驗研究發現，灰兜巴可改善糖尿病腎病大鼠腎組織病理學及足細胞超微結構改變，減少足細胞丟失，降低蛋白尿。

1 材料

1.1 動物 SPF 級健康雄性SD 大鼠32 只，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，實驗動物生產許可證號SCXK（京）2016-0011，5 周齡，體質量120～140 g。飼養環境恒溫22～24 ℃，相對濕度50%～60%，12 h/12 h 晝夜更替，本實驗經承德醫學院實驗動物倫理委員會許可（實驗動物倫理審查批號201712-007）。

1.2 藥物與試劑 灰兜巴產于四川省峨眉山市雙福鎮，6 月中下旬采摘，曬制，經吉林農業大學李欣教授鑒定為正品，二甲雙胍（1，1-二甲基雙胍鹽酸鹽含有量98.8%，批號H20103205）由石家莊市普力制藥有限公司饋贈；鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）（貨號S0130）購自美國Sigma 公司；尿微量白蛋白（mAlb）測定試劑盒（貨號E038-1-1）、尿肌酐（Ucr）測定試劑盒（貨號C011-1-1）購自南京建成生物工程研究所；PASM 染色試劑盒（貨號G1059）購自武漢賽維爾生物科技有限公司；β-actin 鼠單克隆抗體（貨號AF0003）、蛋白酶磷酸酶抑制劑混合物（通用型，50X，貨號P1045）、預染蛋白質分子量標準（19-117kD，貨號P0066）、RIPA 裂解液（強，貨號P0013B）、BCA 蛋白濃度測定試劑盒（增強型，貨號P0010）、SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒（貨號P0 012 A）、BeyoECL Plus（超敏ECL 化學發光試劑盒）（貨號P0018）、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（5X）（貨號P0015）、PVDF 膜（0.45 μm，26.5 cm×3.75 m，貨號IPVH00010）均購自碧云天生物技術有限公司；Nephrin（B-12）小鼠單克隆抗體（貨號sc-377246）購自美國圣克魯斯生物技術有限公司；山羊抗小鼠IGG（H＆L）二抗（CY3 標記，貨號GB21301）、DAPI 染色試劑（貨號G1012）購自武漢賽維爾生物科技有限公司；50%葡萄糖（武漢市福星生物藥業有限公司，國藥準字H42022230）。

1.3 儀器 高速冷凍離心機（德國Eppendorf 公司）；BK200 全自動生化分析儀（山東博科生物產業有限公司）；ES 自動組織脫水機（美國Thermo公司）；Histocentre 3 組織包埋機（美國Thermo 公司）；RM 2125 輪轉式切片機（德國Leica 公司），TK-218 型恒溫攤片烤片機（湖北泰維醫療科技有限責任公司）；MDF-U4086 超低溫冰箱（日本三洋公司）；Eclipse Ti-SR 倒置熒光顯微鏡（日本Nikon公司）；DS-Ri1-U3 數碼顯微成像系統（日本Nikon公司）；SDS-PAGE 電泳儀（北京六一廠）；轉膜儀（北京六一廠）；Tanon-5200 化學發光凝膠成像系統（天能科技有限公司）；HT7700 型透射電子顯微鏡（日本Hitachi 公司）；強生穩豪倍易型血糖儀［強生（中國）醫療器材有限公司］。

2 方法

2.1 藥物制備 灰兜巴水提物制備，根據當地用藥方式，總結灰兜巴制備工藝參數［4］，并結合預實驗研究結果，委托承德頸復康藥業集團有限公司加工制備。取灰兜巴10 kg，分別加入藥材量10、9、9 倍量的水，藥材浸泡 2 h，沸騰回流（100 ℃）提取3 次，2 h/次；收集提取液，70 ℃減壓濃縮至適當的相對密度（1.02），放至室溫，加入乙醇至乙醇濃度為80%，4 ℃醇沉12 h，過100 目篩，收集水提醇沉部分，真空減壓干燥得灰兜巴水提醇沉物，本次灰兜巴生藥提取率為2.54%。冰上配置1% STZ（10 mg STZ 溶于1 mL檸檬酸檸檬酸鈉緩沖液）后用錫紙包裹，并在15 min內使用。

2.2 糖尿病腎病模型制備 SD 大鼠適應性喂養1周后，隨機選取8 只進入對照組并飼以SPF 級大鼠維持飼料（定義為0 周），其余大鼠以高脂高糖飼料（66.5%大小鼠維持飼料+10% 豬油+20% 蔗糖+2.5%膽固醇+1%膽酸鈉）喂養，6 周后禁食不禁水4 h，一次性腹腔注射1% STZ（65 mg/kg），對照組注射等體積溶媒。注射1 周后禁食不禁水12 h，進行口服葡萄糖耐量試驗（oral glucose tolerance test，OGTT），50% 葡萄糖備用，用于低血糖昏迷灌胃搶救。以空腹血糖（Fasting blood glucose，FBG）≥11.1 mmol/L［5-7］，OGTT 實 驗AUC 升高2 倍，視為造模成功。采用隨機數字表法將造模成功大鼠分為模型組（n＝8），二甲雙胍組（n＝8），灰兜巴組（n＝8）。

2.3 給藥 課題組前期糖尿病腎病大鼠動物預實驗結合灰兜巴當地用藥量設計灰兜巴水提物凍干粉高、中、低劑量組，其中以高劑量組（180 mg/kg）效果最為明顯，確定灰兜巴組給藥劑量（180 mg/kg）。參考魏偉主編第4 版《藥理實驗方法學》，按種屬間體表面積換算大鼠二甲雙胍等效劑量為45 mg/kg。用0.5% 羥甲基纖維素鈉（CMC-Na）混懸灰兜巴水提醇沉物凍干粉和二甲雙胍粉末，按1 mL/100 g 灌胃給藥。對照組和模型組每天于固定時間灌胃等體積0.5% CMC-Na，灌胃6 d，休息1 d，如此連續干預6 周。

2.4 給藥前后OGTT 實驗 分別于藥物干預前（第7 周）和藥物干預后（第13 周）進行OGTT實驗。禁食不禁水12 h，50% 葡萄糖溶液（2 g/kg）灌胃，并于0、30、60、90、120 min，用強生穩豪血糖儀測尾尖血糖。根據近似梯形面積計算AUC（mmol/L·h）＝［（BG0+BG30）×0.5/2］+［（BG30+BG60）×0.5/2］+［（BG60+BG90）×0.5/2］+［（BG90+BG120）×0.5/2］（BG 分別代表糖負荷后各時間點的血糖值）。

2.5 全自動生化分析儀檢測藥物干預前后尿液mAlb/Ucr 分別于藥物干預前后用代謝籠收集大鼠24 h 尿液，期間自由飲食。取1 mL 尿液于1.5 mL離心管中，4 ℃下2 000 r/min 離心10 min，取上清，全自動生化分析儀檢測mAlb、Ucr，并計算二者比值。實驗結束時，腹腔注射氯胺酮（10 mg/100 g）麻醉大鼠，脫頸椎法處死大鼠，剖腹取出腎臟，一側用于組織病理學及超微結構觀察，另一側切小塊后-80 ℃保存。

2.6 腎臟組織PASM 染色 4 ℃預冷生理鹽水沖洗腎臟組織后投入10% 福爾馬林中性固定液固定48 h，經充分流水沖洗，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，浸蠟，石蠟包埋。常規病理切片，厚度約4 μm，脫蠟至水，高碘酸染色，烏洛托品儲備液孵育染色，顯色以腎小球毛細血管基膜呈黑色為準，硫代硫酸鈉處理，復染伊紅，脫水封片，光鏡下觀察腎臟組織病理學改變。

2.7 Western blot腎組織勻漿液，4 ℃下7 500 r/min離心5 min，棄上清液。加PBS 溶液重復清洗2～3 次至組織無血色，按說明加入RIPA 裂解液（150～250 μL/20 mg），4 ℃下10 000 r/min離心20 min，取上清，按BCA 蛋白質定量試劑盒操作測定蛋白濃度。經煮蛋白、電泳、轉膜、封閉，用TBST 溶液稀釋一抗，4 ℃孵育過夜。TBST溶液洗膜后，加入與一抗對應來源的二抗室溫慢搖孵育2 h，再用TBST 溶液洗膜，ECL 發光液進行顯色，化學發光凝膠成像系統曝光。以β-actin 為內參分析Nephrin 蛋白相對表達量。

2.8 免疫熒光分析 腎組織石蠟切片約4 μm 厚，脫蠟至水，用EDTA 抗原修復緩沖液（pH ＝8.0）于微波爐內進行抗原修復，自發熒光淬滅，3%BSA 封閉。按說明書加入Nephrin 一抗（1∶100），4 ℃孵育過夜。再加入與一抗相應種屬的二抗，即山羊抗小鼠IGG（H＆L）二抗（CY3 標記），抗熒光淬滅封片劑封片，于尼康倒置熒光顯微鏡下采集圖像。

2.9 透射電鏡觀察腎臟超微結構 腎臟組織修成1 mm3小塊；3.1%戊二醛于4 ℃冰箱內固定2 h，1%鋨酸后固定1 h，常規電鏡樣品包埋；半薄切片，光鏡下定位選區；超薄切片，片厚60 nm，醋酸雙氧鈾及檸檬酸鉛雙重染色，透射電子顯微鏡觀察腎臟超微結構改變。校準后，選至少30 個點測量腎小球基底膜內層到外層的垂直距離，計算平均腎小球基底膜厚度（thickness of glomerular basement membrane，TGBM）。

2.10 統計學分析 采用SPSS 20.0 軟件進行分析。分析前進行數據正態性分布和方差同質性檢驗，方差齊則采用單因素方差分析；方差不齊或非正態，采用秩和檢驗；對OGTT 重復測量設計資料采用多因素方差分析；并采用LSD 法對多個樣本均數進行兩兩比較。實驗數據以（）表示，檢驗水準α＝0.05。

3 結果

3.1 藥物干預前后OGTT 分析 藥物干預前，與對照組比較，模型組、二甲雙胍組和灰兜巴組大鼠AUC 升高（P＜0.01）；二甲雙胍組和灰兜巴組AUC 與模型組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。藥物干預后，灰兜巴和二甲雙胍均可改善糖尿病腎病大鼠空腹葡萄糖耐量受損情況，二甲雙胍組、灰兜巴組AUC 低于模型組（P＜0.01）。見圖1。

圖1 藥物干預前后OGTT 分析及AUC 比較（n=8）Fig.1 OGTT analysis and AUC comparison before and after medication（n=8）

3.2 給藥前后mAlb/Ucr 比較 藥物干預前，與對照組比較，模型組大鼠尿液 mAlb/Ucr 升高（P＜0.01）；二甲雙胍組和灰兜巴組mAlb/Ucr 與模型組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。藥物干預后，二甲雙胍組和灰兜巴組mAlb/Ucr 低于模型組（P＜0.01），且灰兜巴組mAlb/Ucr 低于二甲雙胍組（P＜0.01），見圖2。

圖2 給藥前后mAlb/Ucr 比較（n=8）Fig.2 Comparison of mAlb/Ucr before and after medication（n=8）

3.3 PASM 染色觀察腎組織病理改變 腎組織石蠟切片經PASM 染色后，腎小球基底膜IV 膠原鍍銀呈黑色。模型組可見明顯腎小球管叢系膜擴張伴基底膜增生。灰兜巴和二甲雙胍可明顯減輕腎小球病理改變（圖3）。

3.4 腎組織Nephrin 蛋白表達 Western blot 結果顯示，與對照組比較，模型組足細胞標志蛋白Nephrin 表達下降（P＜0.01），灰兜巴和二甲雙胍可減輕模型大鼠足細胞Nephrin 下降情況（P＜0.05，P＜0.01），且灰兜巴組Nephrin 蛋白表達高于二甲雙胍組（P＜0.01），見圖4。

3.5 腎組織足細胞Nephrin 熒光檢測 為驗證Nephrin 蛋白表達結果，進行腎組織石蠟切片免疫熒光檢測，觀察腎小球足細胞丟失情況。免疫熒光檢測結果顯示，模型組大鼠腎小球足細胞標志蛋白Nephrin（CY3 標記）表達明顯減少。灰兜巴和二甲雙胍組可明顯減輕足細胞Nephrin 下降情況（圖5）。

圖3 PASM 染色觀察腎小球組織病理改變（×400）Fig.3 Pathological changes examined by PASM staining（×400）

圖4 腎組織Nephrin 蛋白表達（n=3）Fig.4 Protein expression of Nephrin in kidney（n=3）

圖5 腎組織Nephrin 免疫熒光檢測（×200）Fig.5 Expression of Nephrin by immunofluorescence assay（×200）

3.6 透射電鏡觀察腎小球超微結構 利用透射電子顯微鏡觀察足細胞和腎小球基底膜超微結構改變情況，進一步驗證足細胞標志蛋白Nephrin 表達結果。對照組腎小球基底膜清晰，足細胞形態完整；模型組腎小球基底膜不規則增厚，足突廣泛融合，足細胞可見明顯線粒體嵴斷裂或空泡化；灰兜巴和二甲雙胍可明顯改善腎小球基底膜增厚和足細胞足突融合情況（圖6）。TGBM 測量結果進一步為上述觀察提供佐證，與對照組比較，模型組TGBM增厚（P＜0.01）；灰兜巴組和二甲雙胍組可改善TGBM 增厚情況，灰兜巴組TGBM 低于模型組和二甲雙胍組（P＜0.01），見圖7。

圖6 電鏡觀察腎小球超微結構改變（×12 500）Fig.6 Ultrastructure changes under TEM（×12 500）

圖7 腎小球平均基底膜厚度（n=3）Fig.7 Mean thickness of glomerular basement membrane（n=3）

4 討論

現有研究報道多采用尾尖采血測空腹血糖或隨機血糖作為成功造模判定標準［8-9］，但課題組預實驗發現造模后大鼠血糖不穩定，存在造模成功，但檢測時可能因發生低血糖反應，而未被檢測出高血糖的情況；或造模不成功，存在一過性高血糖而被判定為造模成功的情況，因此單獨以此為標準判定成模與否缺乏嚴謹性。本研究將空腹血糖檢測結果與OGTT 分析結果結合起來，以空腹血糖大于11.1 mmol/L，且OGTT 時間-血糖曲線下面積升高2 倍，作為造模成功判定標準。實驗結束時，灰兜巴組AUC 仍高于對照組，說明灰兜巴組大鼠仍存在2 h 葡萄糖耐量受損的情況。

有研究表明，在糖尿病腎病早期即出現不同程度足細胞損傷，因此，足細胞損傷在該疾病發病中的重要作用倍受關注［10-11］。足細胞即腎小球臟層上皮細胞，附著于腎小球基底膜外側，參與構成腎小球濾過膜的最后一道屏障。Nephrin 為足細胞裂孔隔膜的主要成分，在糖尿病腎病患者中其表達明顯下降，且下降程度與蛋白尿的進展呈正相關［12］。檢測尿液mAlb/Ucr 發現，糖尿病腎病大鼠發生大量蛋白尿（＞30 μg/mg），課題組通過Western blot法和免疫熒光法檢測進一步發現，大鼠腎小球Nephrin 表達明顯減少，提示存在足細胞丟失，而灰兜巴可明顯減輕糖尿病腎病大鼠腎小球足細胞丟失情況，透射電鏡觀察結果與此相互印證。

更有趣的是，在透射電鏡觀察中發現模型組大鼠存在明顯的線粒體嵴消失或空泡化。而新近研究表明，線粒體動力學在2 型糖尿病及其血管并發癥中起著至關重要的作用，線粒體動力學失衡可致線粒體功能障礙，ATP 合成減少，線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）減少，線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential，MMP）丟 失，最終以線粒體凋亡通路致足細胞凋亡，加速糖尿病腎病的發生發展［13-14］。強烈提示高糖環境所誘發的足細胞線粒體動力學失衡是否為導致足細胞凋亡、丟失的始動因素？ 這將為下一步從源頭上挖掘灰兜巴發揮糖尿病腎病保護作用機制提供有價值線索。

此外，該實驗結果表明，灰兜巴降糖效果雖然不如二甲雙胍療效顯著，但其對糖尿病腎病大鼠的腎臟保護作用明顯優于二甲雙胍。中醫理論認為，糖尿病腎臟病屬于“消渴病-下消”范疇，消渴失治或治之不當，則致氣陰兩虛，脾腎兩虛，日久則致氣血陰陽俱虛，腎絡瘀結、濁毒內停。臨床治療早期糖尿病腎病以益氣養陰療效較好［15］，該實驗結果將進一步為臨床應用益氣養陰藏藥灰兜巴治療糖尿病腎病提供可靠實驗依據。