白果內酯對Aβ25-35 誘導HT22 細胞損傷及NLRP-1 炎癥小體激活的影響

黃茸茸，陸松俠，許 燕，李維祖

（1.安徽新華學院藥學院藥理教研室，安徽 合肥 230088；2.安徽醫科大學藥理學教研室，抗炎免疫藥理學教育部重點實驗室，國家中醫藥管理局中藥藥理三級實驗室，安徽 合肥 230032）

阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是一種起病隱匿的中樞神經退行性疾病，病因復雜且機制未明，臨床治療難度較大。隨著我國人口老齡化水平的日益加重，該病的發病率呈持續升高趨勢，家庭和社會負擔沉重，因此，尋找有效的治療藥物迫在眉睫。近年來有研究［1］顯示，β-淀粉樣蛋白（β-amyloid，Aβ）在腦內沉積介導的氧化應激所致的慢性炎癥反應是導致神經元凋亡與神經元退行性病變的重要因素之一。因此，抑制氧化應激導致的細胞炎癥反應被認為是防治神經退行性病變的有效策略。炎癥小體是由胞漿內模式識別受體（PRRs）參與組裝的多蛋白復合物，是與免疫炎癥反應密切相關的關鍵性物質，主要負責促進相關促炎因子的形成。炎癥小體激活后可通過活化caspase-1 來切割pro-IL-1β 和pro-IL-18，使其裂解成熟并介導機體炎癥反應的發生和發展。研究［2］表明，炎癥小體核苷酸結合NLRP-1 參與了神經退行性疾病的病理過程，在小鼠AD 模型中，Aβ 可通過破壞小膠質細胞的溶酶體來激活NLRP-1，表明NLRP-1 活化促進了老年癡呆癥的病理發展，而NADPH 氧化酶-ROS 生成增加也是激活炎癥小體的主要途徑之一［3］。因此，推測Aβ 誘導的神經元細胞損傷可能與NADPH 氧化酶-ROS 途徑導致的NLRP-1炎癥小體激活有關。

銀杏葉提取物是治療AD 的常用中藥，而白果內酯（Bilobalide）是銀杏葉提取物中重要的生物活性成份，其在神經保護以及促進神經生長等方面發揮著重要作用［4］。已有研究結果表明，白果內酯能改善Aβ25-35誘導的AD 模型大鼠的學習記憶能力，對大腦皮層和海馬神經元也具有較好的保護作用［5］。NADPH 氧化酶誘導的ROS 生成增多能夠使海馬神經元NLRP1 炎癥小體激活從而促進神經元損傷［6］。白果內酯是否可通過抑制ROS 生成來抑制神經元NLRP-1 炎癥小體的活化，參與對Aβ25-35誘導海馬神經元損傷的保護作用目前尚不清楚。因此，本研究采用Aβ25-35誘導的小鼠海馬神經元HT22 細胞損傷模型，觀察白果內酯對HT22 細胞損傷的保護作用是否與其干預ROS 生成過多所致的NLRP-1 炎癥小體激活有關。

1 材料

1.1 細胞株 小鼠海馬神經元細胞HT22（編號BNCC337709），購于北京北納創聯生物技術研究院。

1.2 藥物與試劑 白果內酯（純度≥98%，美國sigma 公司，批號20160612）；Aβ25-35（美國sigma公司，批號20160503）；胎牛血清（美國Gibco 公司，批號1227697）；DMEM/F12（美國Gibco 公司，批號1868819）；活性氧（ROS）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號E004-1-1）；CCK-8 檢測試劑盒（碧云天生物技術研究所，批號C0038）；IL-1β、IL-6、TNF-α 檢測ELISA 試劑盒（碧云天生物技術研究所，批號分別為PI301、PI326、PT512）；兔抗NLRP-1 多克隆抗體、兔抗casepase-1 多克隆抗體（英國Abcam 公司，貨號分別為ab3685、ab1874）；兔抗ASC 多克隆抗體（美國Santa cruz 公司，批號sc-33956）；β-actin 單克隆抗體（北京中杉金橋生物有限公司，批號TA-07）；Annexin V-FITC/PI 凋亡檢測試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，批號E-CKA211）；其他試劑均為國產分析純。

1.3 儀器 無菌超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司）；5% CO2恒溫培養箱（力康生物醫療科技控股集團）；FACS Calibur 流式細胞儀（美國BD 公司）；PowerPac200 Western blotting 電泳儀（美國伯樂公司）；IX-71 熒光倒置顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；756MC 紫外可見分光光度計（上海元析儀器有限公司）；TGL16H 高速低溫離心機（珠海黑馬儀器有限公司）；Mini-PROTEAN?Tetra 電泳槽（美國Bio Rad 公司）；PowerPacTM電泳儀（美 國Bio Rad 公司）；全波長酶標儀（美國Thermo Fisher 公司）；96孔培養板（美國Costar 公司）；Tanon-4500 全自動化學發光圖像分析系統（上海天能科技有限公司）；Image-Pro Plus（IPP 7.0）圖像處理分析軟件（美國Media Cybernetics 公司）。

2 方法

2.1 分組與給藥 取對數生長期的小鼠海馬神經元HT22 細胞，分為對照組、模型組（Aβ25-35，1 μmol/L）及白果內酯低、中、高劑量組（6、12、24 μmol/L），NADPH 氧化酶抑制劑（DPI，15 μmol/L）陽性對照組。用完全培養基于37 ℃、5% CO2培養箱中培養24 h。除對照組，其余各組均以Aβ25-35（1 μmol/L）刺激細胞，并分別給予白果內酯和DPI 干預，作用24 h 后檢測相關指標。

2.2 CCK-8 法檢測HT22 細胞活力 細胞藥物處理24 h 后，小心棄去孔內培養液，向每孔加入20 μL CCK-8 溶液，放入37 ℃、5%CO2培養箱繼續孵育2 h，將培養板放置在搖床上搖動5 min，酶標儀在450 nm 波長下測定各孔的吸光度值（OD），按以下公式計算各組細胞存活率。細胞存活率＝［（OD給藥組-OD空白組）/（OD對照組-OD空白組）］×100%。

2.3 流式細胞術DCFH-DA 熒光法檢測HT22 細胞ROS 生成 利用熒光探針DCFH-DA 檢測細胞內ROS 生成。DCFH-DA 本身無熒光，進入細胞后可被水解生成DCFH，而DCFH 無法透過細胞膜。細胞內的ROS 可以將無熒光的DCFH 氧化生成為有熒光的DCF，通過DCF 熒光強度檢測即可反映細胞內ROS 水平。取藥物作用24 h 后的各組細胞制成細胞懸液，移入離心管800 r/min，離心5 min 棄上清。再按ROS 試劑盒說明書加入1 mL 染色工作液（10 μmol/L DCFH-DA），混勻并放入37 ℃細胞培養箱中避光孵育30 min。用無血清細胞培養液重復洗滌細胞3 次，以充分清除未進入細胞內的DCFH-DA。最后在激發波長488 nm，發射波長525 nm 處，使用流式細胞儀（FITC-A 通道）檢測各組細胞內熒光強度。

2.4 ELISA 法檢測HT22 細胞上清中炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α 水平 取給藥24 h 后的各組細胞，吸取培養板每孔上清液100 μL，4 ℃離心10 min，采用雙抗體夾心ELISA 法，按IL-1β、IL-6、TNF-α 細胞因子檢測試劑盒說明書進行測定操作。酶標儀在450 nm 波長下測定各孔吸光度值（OD），通過標準曲線算出各組細胞上清中IL-1β、IL-6、TNF-α 水平。

2.5 Western blot 法檢測HT22 細胞NLRP-1、ASC、caspase-1 蛋白的表達 取給藥24 h 后的各組細胞，棄去細胞培養液，PBS 清洗細胞后每孔加入500 μL 細胞裂解液，裂解5 min，再于4 ℃下11 000 r/min離心10 min，取其上清。將上清液倒入預冷的離心管中，用BCA 法對蛋白進行定量，再加入loading buffer 煮沸變性，SDS-PAGE 凝膠電泳并轉PVDF 膜，轉膜完成后將膜放入5%脫脂奶粉封閉液中室溫孵育1 h，再加一抗（NLRP-1 1∶1 000；ASC 1∶1 000；caspase-1 1∶1 000），于4 ℃冰箱中孵育過夜。TBST 洗滌3 次，10 min/次，加入HRP 標記的二抗（1∶5 000），室溫下孵育1 h，TBST 洗滌3 次，10 min/次。最后加ECL 化學發光劑，用Tanon-4500 化學發光成像系統進行顯影。以β-actin 的表達作為參照，利用Image J 軟件處理目的蛋白的灰度值進行半定量分析。

2.6 Annexin V-FITC/PI 雙染法檢測HT22 細胞凋亡 取給藥24 h 后的各組細胞，2 000 r/min 離心5 min，棄去培養基。用冷PBS 洗滌細胞2 次，用400 μL binding buffer 懸浮細胞，調整濃度約為1×106/mL。在細胞懸浮液中加入5 μL Annexin V-FITC，輕輕混勻后于2～8 ℃避光孵育15 min，再加入10 μL PI 后混勻于2～8 ℃避光孵育5 min，最后在熒光顯微鏡下觀察各組細胞的凋亡情況。

2.7 統計學分析 采用SPSS 17.0 統計軟件進行處理與分析。計量資料以（）表示，多組間比較選用單因素方差分析，組間比較采用t檢驗。以P≤0.05為差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 白果內酯對Aβ25-35誘導的HT22 細胞存活率的影響 與對照組比較，Aβ25-35（1 μmol/L）刺激HT22 細胞24 h 后，細胞存活率下降（P＜0.01）；與模型組比較，白果內酯中、高劑量組（12、24 μmol/L）與陽性對照組（15 μmol/L）的細胞存活率提高（P＜0.01），而白果內酯低劑量組（6 μmol/L），差異無統計學意義。提示白果內酯中、高劑量與DPI 對Aβ25-35誘導的HT22 海馬神經元細胞損傷具有較好的保護作用。見表1。

表1 白果內酯對Aβ25-35 誘導的HT22 細胞存活率的影響（，n=3）Tab.1 Effects of bilobalide on the survival of Aβ25-35-induced HT22 cells（，n=3）

表1 白果內酯對Aβ25-35 誘導的HT22 細胞存活率的影響（，n=3）Tab.1 Effects of bilobalide on the survival of Aβ25-35-induced HT22 cells（，n=3）

注：與對照組比較，##P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01。

3.2 白果內酯對Aβ25-35誘導的HT22 細胞內ROS生成的影響 流式法（FITC-A 通道）測定細胞內ROS 的流式圖中橫坐標代表平均熒光強度，縱坐標代表細胞計數。與對照組比較，模型組細胞平均熒光強度增高（P＜0.01），表明經Aβ25-35誘導后細胞內ROS 生成增多；與模型組比較，白果內酯中、高劑量組（12、24 μmol/L）與陽性藥組細胞平均熒光強度降低（P＜0.05，P＜0.01），白果內酯低劑量組（6 μmol/L），差異無統計學意義。白果內酯能減少Aβ25-35誘導的細胞內ROS 生成，其機制可能與其抑制NADPH 酶有關。見圖1。

圖1 白果內酯對Aβ25-35誘導的HT22 細胞內ROS 生成的影響（，n=3）Fig.1 Effects of bilobalide on ROS generation in Aβ25-35-induced HT22 cells（，n=3）

3.3 白果內酯對Aβ25-35誘導的HT22 細胞炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α 水平的影響 與對照組比較，模型組細胞上清液中細胞炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α 水平增加（P＜0.01）；與模型組比較，白果內酯中、高劑量組（12、24 μmol/L）與陽性對照組 IL-1β、IL-6、TNF-α 水平減少（P＜0.05，P＜0.01），而白果內酯低劑量組（6 μmol/L）僅減少TNF-α 水平（P＜0.05），對細胞因子IL-1β、IL-6 釋放的無影響。見圖2。

圖2 白果內酯對Aβ25-35誘導的HT22 細胞炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α 水平影響（，n=3）Fig.2 Effects of bilobalide on the levels of IL-1β，IL-6 and TNF-α in Aβ25-35-induced HT22 cells（，n=3）

3.4 白果內酯對Aβ25-35誘導的HT22 細胞NLRP-1、ASC、caspase-1 蛋白表達的影響 與對照組比較，Aβ25-35（1 μmol/L）刺激細胞24 h 后，模型組細胞NLRP-1、ASC、caspase-1 蛋白表達增加（P＜0.01）；與模型組比較，白果內酯高劑量組（24 μmol/L）下調NLRP-1、ASC、caspase-1 的蛋白表達（P＜0.01），陽性對照組NLRP-1 與ASC 蛋白表達減少（P＜0.05）。見圖3。

圖3 白果內酯對Aβ25-35誘導的HT22 細胞NLRP-1、ASC、caspase-1 蛋白表達的影響（，n=3）Fig.3 Effects of bilobalide on the expression of NLRP-1，ASC，caspase-1 protein in Aβ25-35-induced HT22 cells（，n=3）

3.5 白果內酯對Aβ25-35誘導的HT22 細胞凋亡的影響 與對照組比較，模型組可提高Annexin V-FITC 染色神經元與PI 染色神經元的比值（P＜0.01）；與模型組比較，白果內酯中、高劑量組（12、24 μmol/L）及陽性對照組 Annexin V-FITC染色神經元與PI 染色神經元的比值下降（P＜0.05，P＜0.01）。見圖4。

4 討論

大量研究顯示，AD 的發病與Aβ 沉積引起的繼發性炎癥反應密切相關。炎癥是機體對于外界刺激的一種防御性反應，但過度的炎癥反應也是導致神經元退行性疾病的重要因素，抗炎治療能一定程度延緩AD 的病程，但具體機制尚不完全清楚。炎癥小體是先天免疫系統中重要的組成部分，近年研究發現，異常活化的炎癥小體能夠導致多種炎性疾病的發生，如痛風、關節炎和中樞神經系統疾病等，而炎癥小體所介導的炎癥反應與中樞神經退行性疾病的發生密切相關［7］。炎性小體是在多種細胞的胞質中存在的多聚體蛋白復合體，激活后的炎癥小體以應對感染或應激信號導致宿主細胞膜受損。NLRP-1 炎癥小體主要由3 種蛋白構成，即NLRP-1、ASC、caspase-1。其中ASC 是接頭蛋白并主要負責催化，NLRP-1 是始動分子，caspase-1 則為效應分子。NLRP-1 通過ASC 招募Pro-caspase-1，caspase-1 激活后可對pro-IL-1β 等炎癥因子前體進行加工，使其成熟并釋放到胞外，誘發神經炎性反應而導致中樞神經系統病變。因此，抑制NLRP-1 炎癥小體活化成為防治AD 的可能機制。另外，ROS過量生成導致的氧化應激亦被認為是在Aβ 介導的神經細胞凋亡中發揮作用的關鍵因素。有研究［8］表明，Aβ 可誘發細胞內ROS 大量蓄積，有助于促進AD 老年斑和神經纖維纏結的形成，使細胞受到氧化性損傷。NADPH 氧化酶是腦內生成ROS 的重要酶系統，已被證明在各種神經系統疾病的發生發展中起著重要作用，通過調控ROS 水平來抑制氧化應激，對防治AD 具有積極意義。

白果（又稱銀杏果）是銀杏樹的種子，是一種含有特異生物活性成分的中藥材，已有研究表明，其在抗菌、抗腫瘤、抗氧化、降壓以及抗炎免疫等方面均具有較好療效，因此，在醫藥保健方面具有很高的研發價值。白果內酯是從銀杏科植物銀杏中提取出來的倍半萜物質，是目前銀杏中最受關注的活性成分，其在心腦血管疾病的臨床治療中已有較確切的療效。課題組前期研究［9］發現，白果內酯可改善癡呆小鼠的學習記憶能力，具有清除自由基、抗氧化、抗炎、擴腦血管與促神經生長等作用，而其神經營養作用更強于銀杏內酯。因此，進一步研究AD 的發生發展機制及白果內酯對AD 的防治作用機制具有非常重要的意義。本課題組前期研究還發現，應激水平的糖皮質激素長期作用可增加腦內ROS 生成，促進NLRP-1 炎癥小體的激活，使炎性因子生成增多，促進小鼠皮層和海馬區神經元的損傷［10］。人參皂苷Rg1 能夠減少ROS 產生，抑制NLRP-1 炎癥小體的激活，從而改善神經元老化和認知功能障礙［11］。因此推測白果內酯可能通過抑制NADPH 氧化酶-ROS 介導的神經元NLRP-1炎癥小體激活，從而減輕Aβ25-35誘導的神經元炎性損傷及細胞凋亡。

圖4 白果內酯對Aβ25-35誘導的HT22 神經元細胞凋亡的影響（，n=3）Fig.4 Effects of bilobalide on neuronal apoptosis in Aβ25-35-inducedHT22 cells（，n=3）

本研究發現，Aβ25-35（1 μmol/L）處理HT22細胞24 h 后，HT22 細胞活力明顯降低，神經元細胞凋亡率、細胞內活性氧ROS 生成、NLRP-1 炎癥小體相關蛋白的表達及IL-1β、IL-6、TNF-α 等炎性細胞因子釋放量均明顯升高。本研究結果表明，ROS 過度生成導致的神經元NLRP-1 炎癥小體激活在Aβ 誘導的神經元炎性損傷中具有十分重要的作用，而白果內酯可通過抑制NADPH 氧化酶-ROS途徑來抑制神經元NLRP-1 炎癥小體激活，從而減輕Aβ25-35誘導的神經元損傷。

本實驗研究的創新之處在于，首次初步探討了白果內酯對Aβ25-35誘導的小鼠海馬神經元HT22 細胞損傷模型的保護作用及其炎性機制，但仍存在諸多不足。臨床和神經病理學研究發現，過度激活的小膠質細胞會導致神經毒性，它們是氧化應激和炎性因子的重要來源。體外實驗也已證實Aβ 可上調星形膠質細胞前體炎性介質的表達，而趨化因子釋放增多則可導致小膠質細胞活化。Aβ 形成后既可直接產生神經細胞毒性作用，又可通過激活神經系統中的膠質細胞釋放炎性介質如ROS、蛋白水解酶、NO 等，對鄰近的神經元產生殺傷作用，同時細胞因子介導的炎性反應又可以促進Aβ 前體蛋白（β-mayloid precursor protein，APP）代謝為Aβ，形成惡性循環［12-15］。因此，白果內酯是否還可通過抑制Aβ 誘導的小膠質細胞炎癥小體激活來發揮神經保護作用及其機制將有待進一步研究。