石見穿多糖通過Wnt/β-catenin 信號通路調控骨肉瘤細胞的遷移和侵襲

李 增，張 瑞，張曉堅，杜書章

（鄭州大學第一附屬醫院 藥學部，河南 鄭州 450000）

骨肉瘤（Osteosarcoma，OS）是世界范圍內最常見的惡性骨腫瘤之一，發病人群多為兒童和青少年，男性發病率高于女性［1］，OS 具有強的轉移性和侵襲性，臨床上，該病具有預后性差、致死率高等特點，一般治療手段為化療加上手術切除，但其惡化程度高，且化療藥耐受性高，因此患者治療后5 年存活率不足70%［2］，此外，化療藥價格昂貴，治療效果差強人意，且副作用較大。

Wnt 通路是生物體細胞內一條進化過程中高度保守的信號通路，近年來在腫瘤細胞的研究中被廣泛關注。Wnt 信號通路分為4 個分支，分別為經典的Wnt/β-catenin 信號通路、Wnt/Ca2+信號通路、調節紡錘體方向和非對稱細胞分裂的路徑以及平面細胞極性路徑［3］，其中Wnt/β-catenin 經典路徑是研究最多的一條分支，該信號路徑能調控腫瘤細胞的增殖、凋亡、細胞間質化等多個方面的生物學功能［4］。大量研究表明，Wnt/β-catenin 通路的異常激活與多種癌癥有關［3］，同時有研究證實，Wnt/β-catenin 通路與OS 的發生發展密切相關［4］。

石見穿為唇形科鼠尾草屬植物華鼠尾草，其有效成分石見穿多糖已被證實具有良好的抗癌效果，對多種腫瘤細胞有抑制作用［5］，但其對OS 的作用影響尚鮮有報道。本研究擬探討石見穿多糖能否對人OS MG63 細胞系的生物學行為產生影響，及其可能存在的作用機制，為臨床OS 的治療尋找新的有效藥物提供理論支撐。

1 材料

1.1 細胞株 人OS MG63 細胞株購自中國科學院上海細胞庫。

1.2 藥物與試劑 石見穿多糖（SBPs）購自上海將來實業股份有限公司（國藥準字H20180625）；含雙抗的1640 培養基（批號M0655）、胎牛血清（批號M4667）購自美國Gibco 公司；TRIzol（批號A001-3-2）、逆轉錄試劑盒（批號A005-1-2）購自美國Invitrogen 公司；β-catenin 引物由上海生工生物工程有限公司合成；兔抗人Vimentin（批號ab190321）、E-cadherin（批號ab180323）一抗購自上海艾博抗貿易有限公司；鼠抗人β-actin（批號AF5001）購自碧云天生物技術有限公司；Transwell小室（批號ab195443）購自上海艾博抗貿易有限公司。

1.3 儀器 雙人水平超凈工作臺（上海巴玖實業有限公司）；二氧化碳細胞孵育箱（美國Thermo公司）；低溫高速離心機（美國Thermo 公司）；S1000 型PCR 擴增儀（美國Bio-Rad 公司）；電轉儀系統（美國Bio-Rad 公司）；DYC-p32 型電泳儀（上海巴玖實業有限公司）；轉膜儀（南京生興生物經濟技術有限公司）；圖像記錄分析系統：大連Jim-X Scientific 公司；倒置熒光顯微鏡（DMIL LED Fluo，德國Leica 公司）。

2 方法

2.1 細胞復蘇和培養 將凍存的人OS MG63 細胞株解凍、復蘇，培養于含10%胎牛血清和1%雙抗的1640 培養液中，于37 ℃、5%CO2的恒溫培養箱中培養，待其貼壁。每天注意觀察細胞的生長狀態，以細胞液的顏色、形狀判斷是否需要換液，換液周期一般為2～3 d。待細胞生長匯合度達到80%以上時，則需要進行傳代，傳代比例一般為1∶5～1∶8。

2.2 劃痕實驗檢測石見穿多糖對人OS MG63 細胞遷移能力的影響 將人OS MG63 細胞以約5×105/孔接種于6 孔板，于細胞培養箱中繼續培養16 h 后，加入含不同濃度石見穿多糖的細胞培養液，加入藥物濃度分別為 0（對照組）、0.25、0.5、1 mg/mL，每組設置6 個復孔［6］。在培養箱中繼續培養24 h，用不含FBS 的RPMI-1640 培養液饑餓處理12 h；用10 μL 的移液槍頭垂直于板面劃痕，每4 小時觀察一次細胞遷移狀態，于倒置熒光顯微鏡下拍照，用作圖軟件處理，比較每組細胞0 h 和24 h 的劃痕寬度。

2.3 Transwell 小室檢測石見穿多糖對人OS MG63細胞侵襲能力的影響 將OS MG63 細胞與不同濃度的石見穿多糖（0、0.25、0.5、1 mg/mL）共培養24 h，加入不含FBS 的培養基，饑餓處理12 h，胰蛋白酶消化后，將細胞洗滌、離心，用不含FBS的培養基重懸細胞，調整細胞濃度約2×105/mL；將小室置于24 孔板內，加入300 μL 含10%FBS 的RPMI-1640 培養液，室溫下靜置30 min 左右，使基質膠水化，向外室內加入500 μL 含10%FBS 的RPMI-1640 培養液，將200 μL 單細胞懸液接種于小室內，培養24 h 后，進行GISMA 染色，向每孔加入400 μL A 液染色4 min，加入800 μL B 液染色8 min，用棉簽擦拭小室內側，流水沖洗染液；用手術刀片將膜取下，置于載玻片上，于倒置顯微鏡下觀察、計數并拍照；每張玻片取上下左右中5個視野計數細胞，取平均數。

2.4 RT-PCR 檢測石見穿對人OS MG63 細胞βcateninmRNA 表達的影響 將OS MG63 細胞與不同濃度的石見穿多糖（0、0.25、0.5、1 mg/mL）共培養24 h，TRIzol 提取細胞總RNA，行逆轉錄反應。取2 μLRNA 進行PCR 擴增，引物序列，內參β-actin正向5′-CTACGTCGGCTTAGCGCAAC-3′，反向5′-TAGGCTTAGCTAGCTTCGAA-3′；β-catenin正向 5′-TAGGCTTAGCTAGCCTAGCC-3′，反向 5′-TAGCGGCTATCGGCTAGCAC-3′，擴增條件為94 ℃預變性2 min，1 個循環；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共35 個循環；72 ℃總延伸6 min。取5 μL PCR 擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，紫外線投射儀下觀察電泳條帶，分析系統分析目的基因和參比基因的條帶灰度值。

2.5 Western blot 檢測石見穿對人OS MG63 細胞Vimentin、E-cadherin 蛋白表達的影響 將OS MG63 細胞與不同濃度的石見穿多糖（0、0.25、0.5、1 mg/mL）共培養24 h，用RIPA 細胞裂解液裂解，提取蛋白質，進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳結束后將蛋白質轉移至NC 膜，置于含有5%脫脂奶粉的TBST 中搖育封閉2 h；加入稀釋后的一抗，TBST 洗滌；加入二抗，TBST 洗滌，ECL顯色；將膠片掃描后用Bandscan 5.0 軟件進行灰度分析。

2.6 統計學分析 采用SPSS 19.0 軟件進行統計分析。計量資料以（）表示，多組間的比較用方差分析分析，組內兩兩比較用LSD-t檢驗。以P≤0.05為差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 石見穿多糖對人OS MG63 細胞遷移能力的影響 石見穿多糖組劃痕比值（24 h/0 h）高于對照組（P＜0.01），且隨著藥物濃度的增加，劃痕比值隨之增加，呈劑量依賴性，說明石見穿多糖能抑制細胞的遷移。Transwell 結果顯示，石見穿多糖組細胞透過上室Matrigel 膠的數量少于對照組（P＜0.01），隨著石見穿多糖濃度的增加，侵襲細胞數逐漸減少，呈劑量依賴性，說明石見穿多糖能抑制細胞的侵襲能力。見圖1～2、表1。

圖1 劃痕檢測各組人OS MG63 細胞遷移（×40）Fig.1 Detection of human OS MG63 cells migration by scratch test（×40）

圖2 Transwell 檢測各組人OS MG63 細胞侵襲能力（×20）Fig.2 Detection of the invasion ability of human OS MG63 cells in each group by Transwell（×20）

表1 石見穿多糖對人OS MG63 細胞遷移、侵襲能力的影響（，n=3）Tab.1 Effects of SBPs on the migration and invasion ability of human OS MG63 cells（，n=3）

表1 石見穿多糖對人OS MG63 細胞遷移、侵襲能力的影響（，n=3）Tab.1 Effects of SBPs on the migration and invasion ability of human OS MG63 cells（，n=3）

注：與對照組比較，**P＜0.01；與0.25 mg/mL 石見穿多糖組比較，##P＜0.01；與0.5 mg/mL 石見穿多糖組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

3.2 石見穿多糖對人OS MG63 細胞β-cateninmRNA 表達的影響 石見穿多糖組β-cateninmRNA表達低于對照組（P＜0.01），且隨著藥物濃度的增加，β-cateninmRNA 的表達逐漸減弱。見圖3、表2。

圖3 RT-PCR 檢測各組人OS MG63 細胞β-catenina mRNA表達Fig.3 Detection of β-catenina mRNA expression of human OS MG63 cells in each group by RT-PCR

3.3 石見穿多糖對人OS MG63 細胞E-cadherin、Vimentin 蛋白表達的影響 石見穿多糖組細胞E-cadherin蛋白的表達高于對照組（P＜0.01），且隨著藥物濃度的增加，呈劑量依賴性；石見穿多糖組細胞Vimentin 蛋白表達弱于對照組（P＜0.05，P＜0.01），且該抑制作用隨著藥物濃度的增加而增加。見圖4、表2。

圖4 Western blot 檢測各組人OS MG63細胞蛋白表達Fig.4 Detection of protein expression of human OS MG63 cells in each group by Western blot

表2 石見穿多糖對人OS MG63 細胞β-catenin mRNA 及E-cadherin、Vimentin 蛋白表達的影響（，n=3）Tab.2 Effects of SBPs on the expression of β-catenin mRNA，E-cadherin and Vimentin protein in human OS MG63 cells（，n=3）

表2 石見穿多糖對人OS MG63 細胞β-catenin mRNA 及E-cadherin、Vimentin 蛋白表達的影響（，n=3）Tab.2 Effects of SBPs on the expression of β-catenin mRNA，E-cadherin and Vimentin protein in human OS MG63 cells（，n=3）

注：與對照組比較，* P ＜0.05，**P ＜0.01；與0.25 mg/mL 石見穿多糖組比較，## P ＜0.01；與0.5 mg/mL 石見穿多糖組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

4 討論

遷移和侵襲是OS 細胞最主要的特點，也是導致癌癥惡化和擴散的最主要原因［7］。上皮間質轉化（epothelial-mesenchymal transition，EMT）指源于上皮的腫瘤細胞失去極性而向具有間質表型細胞轉化的過程，在此過程中，上皮細胞粘附性降低，極性消失，使細胞的轉移和侵襲能力增強［8］。Wnt/β-catenin 信號通路是導致EMT 的重要因素［8］，正常細胞β-catenin 與E-cadherin 相結合形成復合體，維持細胞的極性，使細胞間接觸穩定，限制細胞的移動；當Wnt 通路被異常激活時，該復合體被破壞，細胞 E-cadherin 表達下降，Vimentin 等能刺激細胞移動的蛋白表達上調，各種蛋白相互作用，使細胞失去極性，細胞間連接變得疏松，從而導致細胞粘附力下降，移動能力增強，發生遷移或侵襲［7-8］。有研究證實，在OS 細胞中，Wnt 信號通路的異常激活促進了腫瘤的增殖和早期肺部轉移，而抑制Wnt 通路的活性可以抑制OS 干細胞的自我更新，從而抑制癌癥的侵襲性和耐藥性［9］。

石見穿多糖在臨床上多用于治療各種感染性疾病，近年來，大量藥理實驗證實其對多種細胞系具有細胞毒性作用，能誘導細胞凋亡和線粒體損傷，同時能通過對血管內皮生長因子、白細胞介素的調控而抑制腫瘤細胞的轉移和侵襲［10］，但其對于膀胱癌細胞的影響尚鮮有研究。本研究發現，石見穿多糖能顯著抑制人OS 細胞的轉移和侵襲，且在一定范圍內呈現劑量依賴性。

β-catenin 是該通路的核心因子，大量研究發現，癌癥的發生與Wnt/β-catenin 信號通路的異常激活有關［3］，結直腸癌、乳腺癌、前列腺癌細胞質都存在β-catenin 的聚集［11-12］，有學者發現OS 細胞核內 β-catenin 的表達顯著增加，而敲除β-catenin后，膀胱癌細胞的遷移核侵襲能力都有所減弱［13］。本研究以β-catenin 作為Wnt 經典通路的標志因子，用不同濃度的石見穿多糖與人OS MG63 細胞共培養24 h，石見穿多糖能顯著抑制細胞內β-cateninmRNA 表達，且呈現劑量依賴性，提示石見穿多糖可能對人OS 細胞內Wnt/β-catenin信號通路的活性具有抑制作用。

E-cadherin 的表達缺失是EMT 過程中的重要標志。在許多類型的腫瘤中，可以通過恢復E-cadherin 的表達而抑制腫瘤細胞的遷移和侵襲［7，14］。體外研究證實，通過給E-cadherin 表達缺陷的細胞轉染該蛋白基因后，腫瘤的侵襲性消失［15］。本研究發現，石見穿多糖能刺激細胞內E-cadherin 的表達，且隨著藥物濃度的增加，E-cadherin的表達隨之增加，推測石見穿多糖可能通過刺激人OS MG63 細胞內E-cadherin 表達而抑制EMT 過程，從而減弱細胞的遷移和侵襲能力。

同一腫瘤細胞系中，占主導地位的E-cadherin負性化的作用導致癌癥細胞播散，并增加了細胞內Vimentin 的活性。Vimentin 屬于中間絲家族成員，其主要作用在于調節細胞收縮、粘附和遷移其作為間質細胞的標志性蛋白，是EMT 途徑另一重要的蛋白之一［16］。實驗結果發現，石見穿多糖在刺激人OS MG63 細胞內E-cadherin 表達的同時，抑制了Vimentin的表達。石見穿多糖可能通過刺激人OS細胞內E-cadherin 表達，抑制Vimentin 的表達，而阻斷細胞內EMT 過程，從而減弱細胞的遷移和侵襲能力。

綜上所述，石見穿多糖能抑制人OS MG63 細胞的遷移和侵襲能力，這種作用可能使通過抑制Wnt/β-catenin 信號通路的活性，從而阻斷細胞內EMT 過程而引起的。